高 巍，張曉琪，景桂霞，宋平義，南克俊，沙保勇

（1．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710061；2．西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；3．西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，陜西西安 710021）

我國肝癌發(fā)病率逐年升高，已居世界首位，并出現(xiàn)年輕人群高發(fā)的趨勢［1］。手術(shù)切除是現(xiàn)在肝癌治療的重要方法之一，而患者圍術(shù)期及后續(xù)治療過程中均需要控制疼痛，其中舒芬太尼是臨床麻醉和疼痛治療中最常用的鎮(zhèn)痛藥。舒芬太尼為強(qiáng)效阿片類鎮(zhèn)痛藥物，屬于苯基哌啶類，具有穩(wěn)定的時(shí)量相關(guān)半衰期，無蓄積及抑制呼吸等副作用，為取代嗎啡等藥物的“后起之星”［2］。阿片類藥物在腫瘤治療中的廣泛使用，使人們越來越關(guān)注其對腫瘤細(xì)胞的影響。而這種影響存在雙面性，既能誘發(fā)瘤細(xì)胞擴(kuò)散［3-4］，又能加速腫瘤細(xì)胞的凋亡［5-7］。目前，阿片類藥物對腫瘤細(xì)胞影響的研究多見于嗎啡，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道舒芬太尼對肝癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)人肝癌Hep3B細(xì)胞，觀察舒芬太尼對肝癌細(xì)胞活性的影響，并檢測Hep3B細(xì)胞周期及凋亡的變化和survivin及caspase-3蛋白的表達(dá)，以期為舒芬太尼在腫瘤治療中的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購買自Hyclone；舒芬太尼（枸櫞酸舒芬太尼注射液）購買自宜昌人福藥業(yè)有限公司，批號090501；細(xì)胞周期及Annexin-FITC／PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司；其他試劑耗材，如非特殊說明，均購買自Sigma。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌Hep3B細(xì)胞由西安交通大學(xué)泌尿外科及腫瘤科實(shí)驗(yàn)室提供，DMEM培養(yǎng)液（每500mL培養(yǎng)液中需添加50mL的胎牛血清）、37℃和50mL／L CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)好的細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．3 細(xì)胞活性檢測 將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100μL（約5×103個(gè)細(xì)胞）。待Hep3B細(xì)胞貼壁后，加入0．01、0．1、1、5、10、15μmol／L的舒芬太尼，分別培養(yǎng)24、48、72h。孵育完成后，棄去96孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液并用PBS清洗。加入含有5mg／mL MTT的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4h，孵育完成后棄去培養(yǎng)液，加二甲基亞砜振蕩溶解結(jié)晶物。以630nm為參照，測量570nm處的吸光度值。所有實(shí)驗(yàn)以正常生長的Hep3B細(xì)胞為對照組。

1．4 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測 將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液加入6孔板中，每孔細(xì)胞約5×104個(gè)。待Hep3B細(xì)胞貼壁后，加入1、5、10、15μmol／L的舒芬太尼，培養(yǎng)48h。孵育完成后，消化并收集每孔的細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液清洗。700mL／L冷乙醇固定，4℃過夜，離心棄去固定液，PBS清洗2次，用含100 mg／L RNA酶和10mg／L碘化丙錠（PI）的 PBS溶液重懸細(xì)胞。用FACS calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過Multiplus軟件分析細(xì)胞周期。

重復(fù)細(xì)胞周期檢測中細(xì)胞培養(yǎng)、處理、固定、清洗的過程，根據(jù)AnnexinV／PI雙標(biāo)記試劑盒操作步驟，向重懸細(xì)胞中加入PI和FITC，室溫避光反應(yīng)后，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，計(jì)算凋亡率。

1．5 survivin和caspase-3蛋白表達(dá)測定 提取Hep3B細(xì)胞總蛋白，并用BCA定量。蛋白樣品加loading buffer后煮沸使其充分變性，用SDS-PAGE電泳分離目標(biāo)蛋白，經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（1∶5 000）及二抗（1∶10 000）孵育后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。收集圖像后，灰度掃描蛋白條帶，進(jìn)行吸光度值分析。

1．6 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3～6個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。所有的結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過SPSS 13．0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)及ANOVA檢測，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 舒芬太尼對Hep3B細(xì)胞活性的影響 舒芬太尼0．01、0．1、1、5、10、15μmol／L組的 Hep3B細(xì)胞，共同孵育24、48、72h，與對照組細(xì)胞相比，Hep3B細(xì)胞活性隨舒芬太尼濃度的增加而減??；當(dāng)舒芬太尼濃度大于1μmol／L，孵育時(shí)間超過48h，肝癌細(xì)胞活性出現(xiàn)顯著性降低（P＜0．05），變化呈現(xiàn)濃度依賴性（圖1）。如當(dāng)濃度為5、10、15μmol／L的舒芬太尼分別與肝癌Hep3B細(xì)胞孵育72h后，肝癌細(xì)胞活性分別 降 低 到 （82．8±3．2）% （P＝0．012）、（75．9±2．4）%（P＝0．009）和（70．1±2．8）%（P＝0．001）；而舒芬太尼與Hep3B細(xì)胞共同孵育24h，細(xì)胞活性未顯著性改變（圖1）。

圖1 不同濃度舒芬太尼對Hep3B細(xì)胞活性的影響Fig．1 The effects of different concentrations of Sufentanil on Hep3Bcell viability

2．2 舒芬太尼對Hep3B細(xì)胞周期的影響 基于細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取1、5、10和15μmol／L舒芬太尼處理48h，通過FACS calibur流式細(xì)胞儀檢測Hep3B細(xì)胞周期變化，與正常對照組相比，隨著舒芬太尼濃度的增加，G0／G1期的比例顯著性增加，S期的比例顯著性降低，而G2／M期比例變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。可見，舒芬太尼能將Hep3B細(xì)胞停滯在G0／G1期，抑制了細(xì)胞由DNA合成前期向DNA合成期的過渡。

圖2 不同濃度舒芬太尼對Hep3B細(xì)胞周期的影響Fig．2 The effects of Sufentanil of different concentrations on Hep3Bcell cycle

2．3 舒芬太尼對Hep3B細(xì)胞凋亡的影響 舒芬太尼（1～15μmol／L）處理 Hep3B細(xì)胞48h后，用AnnexinV／PI雙染法檢測肝癌細(xì)胞的凋亡情況并計(jì)算其細(xì)胞凋亡率。舒芬太尼能誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，且當(dāng)舒芬太尼濃度大于5μmol／L時(shí)，凋亡率顯著增加，呈劑量依賴性關(guān)系，且均與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖3）。

2．4 舒芬太尼對survivin、caspase-3蛋白表達(dá)的影響 舒芬太尼處理Hep3B細(xì)胞48h后，Western blot檢測結(jié)果表明，與正常對照組相比，經(jīng)1、5、10和15μmol／L舒芬太尼處理后，Survivin表達(dá)量逐步下調(diào)，Caspase-3表達(dá)量逐步升高，量化結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

3 討 論

圖3 不同濃度舒芬太尼對Hep3B細(xì)胞凋亡的影響Fig．3 The effects of Sufentanil of different concentrations on the apoptosis of Hep3Bcells

我國癌癥患者有450萬人，一半以上的患者有不同程度的疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［8］。基于世界衛(wèi)生組織提出的“三階梯治療”方案，中、重度晚期癌癥患者應(yīng)主要給予強(qiáng)效阿片類藥物（如舒芬太尼等）鎮(zhèn)痛治療［9］。舒芬太尼等阿片類藥物在癌癥患者圍手術(shù)期、術(shù)后鎮(zhèn)痛及癌性疼痛治療中廣泛使用，且其沒有“封頂效應(yīng)”，對控制腫瘤患者中、重度癌痛有良好效果。因此，本研究觀察舒芬太尼對肝癌細(xì)胞的作用，而且基于其鎮(zhèn)痛無封頂效應(yīng)，采用舒芬太尼的濃度跨度為0．01～15μmol／L，遠(yuǎn)超出其鎮(zhèn)痛的臨床使用濃度0．001～0．015μmol／L。

圖4 舒芬太尼對Hep3B細(xì)胞survivin及caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig．4 The effects of Sufentanil on the expressions of survivin and caspase-3protein in Hep3Bcells

本研究結(jié)果顯示，隨著舒芬太尼濃度的增加，肝癌細(xì)胞活性降低，細(xì)胞周期停滯在G0／G1期，且細(xì)胞凋亡增多。這與另一種強(qiáng)效阿片類藥物嗎啡的一些研究結(jié)果很相似，如嗎啡能將胰腺癌MCF-7細(xì)胞阻滯在G0／G1期［10］，能將胃癌細(xì)胞 MGC-803阻滯在G2／M期［11］，能誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［7］。

Survivin是一種凋亡抑制蛋白，在人類多種腫瘤中均有表達(dá)，且有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Survivin主要在G2／M期強(qiáng)表達(dá)，而在之后的G1期，其mRNA和蛋白水平迅速下降［12］。Survivin能抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶caspase-3的合成，從而抑制細(xì)胞凋亡［13-14］。本研究結(jié)果顯示舒芬太尼使肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡增多，而survivin蛋白處于一個(gè)低水平表達(dá)，caspase-3表達(dá)增多。

總之，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的舒芬太尼處理體外培養(yǎng)的人肝癌Hep3B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)舒芬太尼能降低肝癌細(xì)胞活性，潛在的作用機(jī)制之一可能是阻滯細(xì)胞到G0／G1期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究明確了舒芬太尼對人肝癌Hep3B細(xì)胞的抑制作用，為舒芬太尼在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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