胡培靜，杜 媛，王 婭，王亭忠，王娟娟，陳春燕，馬愛(ài)群

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061）

SCN5a編碼心臟電壓依賴性鈉通道Nav1．5的α亞基，Nav1．5介導(dǎo)的內(nèi)向電流INa對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)有著重要的作用，決定著心臟電脈沖的興奮性和傳導(dǎo)速度［1］。SCN5a基因突變與多種心律失常的發(fā)生有關(guān)，如功能獲得性突變，引起INa增加，可以導(dǎo)致3型長(zhǎng) QT 綜合征（LQT3）［2-4］，而功能缺失性突變，引起INa降低，可以導(dǎo)致多種心律失常，包括Brugada綜合征（Brugada syndrome，BrS）、進(jìn)行性心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病、病態(tài)竇房結(jié)綜合征及房顫等［5］。其中，R104W 是SCN5a基因的一種錯(cuò)義突變，可以引起B(yǎng)rugada綜合征，此突變是由Jerome Clatot等人在一位33歲無(wú)癥狀的男性患者發(fā)現(xiàn)的，其有典型的BrS 1型心電圖的表現(xiàn)：ST段抬高、V1導(dǎo)聯(lián)T波扭轉(zhuǎn)以及不完全性右束支傳導(dǎo)阻滯。R104W突變引起通道蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，蛋白質(zhì)過(guò)多滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致INa降低，并對(duì)野生型SCN5a有明顯的負(fù)顯性抑制作用［6］，目前尚未有關(guān)于R104W突變糾正的研究。我們?cè)O(shè)計(jì)的本實(shí)驗(yàn)擬在野生型SCN5a的基礎(chǔ)上，用一步法構(gòu)建SCN5a-R104W突變，并用分子生物學(xué)及電生理方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)有關(guān)突變糾正措施的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 人胚胎腎細(xì)胞（HEK 293）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)／中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，野生型人pEGFPSCN5a質(zhì)粒和DH5α細(xì)菌來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及Lipofectamine TM3000購(gòu)自Invitrogen公司，QuickChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自Agilent公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，兔抗hNav1．5單克隆抗體購(gòu)自Alamone公司，山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，引物合成及測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限公司提供。

1．2 突變體pEGFP-SCN5a-R104W的構(gòu)建 根據(jù)定點(diǎn)突變?cè)噭┖幸?，設(shè)計(jì)引物序列如下：5′-TGGTGGCACTGAACCGAAGATGGTCTTGCC-3′，5′-GGCAAGACCATCTTCTGGTTCAGTGCCACCA-3′，引 入突變點(diǎn)310C＞T，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行點(diǎn)突變操作，然后提取質(zhì)粒并測(cè)序。

1．3 基因轉(zhuǎn)染 HEK 293細(xì)胞在含有100mL／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1d，將細(xì)胞鋪于35mm的培養(yǎng)皿中，24h后待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約為70%～80%時(shí)，采用Lipofectamine TM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 法，分 別 轉(zhuǎn) 入 pEGFP-SCN5a-WT 2μg、pEGFPSCN5a-R104W2μg或pEGFP-SCN5a-WT 1μg＋pEGFP-SCN5a-R104W1μg后在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。

1．4 Western blotting檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá) 轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行蛋白定量并變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，按120V、2h的條件轉(zhuǎn)膜，用5g／100mL的TBST脫脂奶粉封閉1h，加入兔抗Nav1．5單克隆抗體（1∶500）4℃過(guò)夜孵育。然后吸去一抗，TBST漂洗3次，每次10min。再加入山羊抗兔二抗（1∶20 000）后室溫孵育1h。吸去二抗，TBST漂洗3次，每次10min，然后用Chemi Doc-XRS發(fā)光儀上成像。

1．5 全細(xì)胞膜片鉗記錄INa采用P-97微電極拉制儀（Sutter公司）拉制玻璃微電極，電阻為3～5MΩ。電極 內(nèi) 液 成 分 為 （mmol／L）：CsCl 130，NaCl 10，EGTA 10，HEPES 10，采用 CsOH 調(diào)節(jié)pH 至7．2；電極外液成分為（mmol／L）：NaCl 140，KCl 4，CaCl21．8，MgCl21，HEPES 10，glucose 10，采用 NaOH 調(diào)節(jié)pH至7．4。選擇狀態(tài)良好的單個(gè)細(xì)胞建立GΩ封接，再給予負(fù)壓破膜形成全細(xì)胞模式，然后記錄INa。

2 結(jié) 果

2．1 DNA測(cè)序證實(shí)突變位點(diǎn)成功建立 DNA測(cè)序結(jié)果顯示，與野生型pEGFP-SCN5a相比，pEGFPSCN5a-R104W突變體第310位由C變?yōu)門(mén)（對(duì)應(yīng)104位氨基酸由R轉(zhuǎn)變?yōu)?W），而其他堿基序列未發(fā)生改變，提示R104W突變體構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 DNA測(cè)序圖顯示R104W突變體第310位由C變?yōu)門(mén)Fig．1 DNA sequencing result showed that the base on 310was changed from C to T of R104Wmutation

2．2 SCN5a-R104W 突變體蛋白質(zhì)表達(dá)降低Western blotting結(jié)果顯示，無(wú)論是轉(zhuǎn)染pEGFPSCN5a-WT還是轉(zhuǎn)染pEGFP-SCN5a-R104W突變體后，HEK 293細(xì)胞均表達(dá)鈉通道蛋白SCN5a，但轉(zhuǎn)染pEGFP-SCN5a-R104W突變體后SCN5a表達(dá)量顯著降低（圖2），符合鈉通道轉(zhuǎn)運(yùn)障礙型突變的蛋白表達(dá)特征。

2．3 SCN5a-R104W突變體蛋白質(zhì)表達(dá)于胞質(zhì) 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，pEGFP-SCN5a-WT轉(zhuǎn)染后主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，而pEGFP-SCN5a-R104W突變體轉(zhuǎn)染后主要表達(dá)于胞質(zhì)，細(xì)胞膜上不表達(dá)。將pEGFP-SCN5a-WT和pEGFP-SCN5a-R104W共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可見(jiàn)既表達(dá)于胞質(zhì)，也表達(dá)于細(xì)胞膜上，但是與單純轉(zhuǎn)染pEGFP-SCN5a-WT相比，細(xì)胞膜上表達(dá)量顯著降低（圖3），這也進(jìn)一步證實(shí)SCN5a-R104W突變體符合轉(zhuǎn)運(yùn)障礙型突變特征。

圖2 Western blotting結(jié)果顯示SCN5a通道R104W突變體蛋白表達(dá)降低Fig．2 Western blotting result showed that protein expression of the R104Wmutation was reduced

2．4 SCN5a-R104W突變體不表達(dá)INa膜片鉗記錄結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-SCN5a-WT的HEK 293細(xì)胞表達(dá)特征性INa，而轉(zhuǎn)染pEGFP-SCN5a-R104W突變體的 HEK 293細(xì)胞不能記錄到INa。將pEGFPSCN5a-WT和pEGFP-SCN5a-R104W共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，同樣可以記錄到與pEGFP-SCN5a-WT轉(zhuǎn)染后形態(tài)相似的INa，但是其峰值電流明顯降低，說(shuō)明SCN5a-R104W突變體對(duì)SCN5a-WT通道有負(fù)顯性抑制作用（圖4）。

3 討 論

圖3 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示pEGFP-SCN5a-WT和pEGFP-SCN5a-R104W的表達(dá)定位Fig．3 Localization of pEGFP-SCN5a-WT and pEGFP-SCN5a-R104Wexpressions

圖4 膜片鉗結(jié)果顯示R104W突變體不表達(dá)INa且對(duì)野生型通道有負(fù)顯性抑制作用Fig．4 Patch clamping result showed that no sodium current was recorded from the cells expressing SCN5a-R104Wmutant channel，and SCN5a-R104Wexerted dominant-negative effect on SCN5a-WT channel

SCN5a編碼的電壓依賴性鈉通道Nav1．5主要參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位快速去極化過(guò)程，同時(shí)在平臺(tái)期也發(fā)揮部分作用［7］。SCN5a基因突變與3型長(zhǎng)QT綜合征（LQT3）、Brugada綜合征、病態(tài)竇房結(jié)綜合征及房顫等心律失常的發(fā)生有關(guān)。

LQT綜合征共有LQT1～LQT13個(gè)亞型，其中，LQT3的發(fā)生與SCN5a突變有關(guān)。LQT綜合征是一種心臟動(dòng)作電位復(fù)極延長(zhǎng)，體表心電圖表現(xiàn)為QT間期延長(zhǎng)，易發(fā)生室性心動(dòng)過(guò)速、室顫、特別是TdP（尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速）等惡性心律失常的疾?。?］。Brugada綜合征是1992年由Brugada兄弟首先發(fā)現(xiàn)并命名的，其特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)生的心臟驟停、非典型的右束支傳導(dǎo)阻滯以及體表心電圖V1-V3導(dǎo)聯(lián)持續(xù)性ST段抬高而心臟的結(jié)構(gòu)正常［9］，目前發(fā)現(xiàn)了13個(gè)可以導(dǎo)致Brugada綜合征的基因，其中SCN5a基因上有300多個(gè)可以引起B(yǎng)rugada綜合征的突變位點(diǎn)［10］。根據(jù)SCN5a突變位點(diǎn)不同可以分為5類：①錯(cuò)義突變，約占66%，如L325R、R1432G、T1620M、C1850S；②移碼突變，約占13%，包括缺失、插入突變等，如delKl479；③無(wú)義突變，約占11%，如Q55X、Q419X；④剪接突變，約占7%；⑤其他突變，約占3%。突變位置主要集中在鈉通道的跨膜區(qū)，約占Brugada綜合征基因突變病例的20%［11］。對(duì)引起B(yǎng)rugada綜合征的SCN5a突變進(jìn)行外源表達(dá)研究后發(fā)現(xiàn)，鈉通道呈現(xiàn)不同程度的功能下降，其機(jī)制包括：①鈉通道表達(dá)減少：通道蛋白合成障礙或細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面功能性鈉通道表達(dá)減少；②鈉通道電流動(dòng)力學(xué)異常：鈉電流激活、失活、恢復(fù)的電壓依賴性和時(shí)間依賴性改變，如激活延遲、失活加快、復(fù)活減慢，或進(jìn)入緩慢恢復(fù)的中間失活狀態(tài)，這些改變均可導(dǎo)致鈉離子通道功能失調(diào)；③既有鈉通道表達(dá)下降，又存在通道動(dòng)力學(xué)特征的改變。鈉通道功能降低，電流減小，導(dǎo)致心臟特別是右心室及右心室流出道傳導(dǎo)速度減慢，從而誘發(fā)折返性心律失常［12］。

Brugada綜合征的治療方法主要包括藥物治療和心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器的植入。藥物治療中主要應(yīng)用的是奎尼丁，其通過(guò)減小Ito電流而減少Brugada綜合征患者心律失常的發(fā)生［13］，尚未有藥物能治愈Brugada綜合征，尤其是針對(duì)突變類型的治療方法。心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器植入是唯一已證實(shí)對(duì)Brugada綜合征治療有效的方法，此外射頻消融術(shù)也是一種新的治療方法［14］。SCN5a錯(cuò)義突變G1406R可以導(dǎo)致Brugada綜合征，研究發(fā)現(xiàn)抗心律失常藥美西律可以在細(xì)胞水平糾正G1406R突變［15］，雖然在體內(nèi)美西律是否同樣能糾正此突變進(jìn)而使患者的心電指標(biāo)恢復(fù)正常還有待進(jìn)一步研究，但此研究至少為Brugada綜合征的治療提供了一種可能有效的新方法。目前尚無(wú)關(guān)于R104W突變糾正方法的報(bào)道，因此，體外構(gòu)建R104W突變載體，深入研究R104W引起B(yǎng)rugada綜合征的分子機(jī)制，進(jìn)而探索其可能的特異性糾正方法，對(duì)于因該突變導(dǎo)致的Brugada綜合征的防治具有重要的理論及實(shí)際意義。

定點(diǎn)誘變是分子生物學(xué)研究中常用的方法，本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的一步法基因誘變技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變技術(shù)，以反向PCR為基礎(chǔ)，以含有目的基因的環(huán)狀質(zhì)粒為模板，用2個(gè)5’端相鄰且磷酸化的誘變引物進(jìn)行反方向延伸，擴(kuò)增產(chǎn)物再用DpnⅠ酶純化（DpnⅠ酶降解甲基化或半甲基化的只含有1條模板鏈的模板鏈，而在體外合成的突變鏈不受DpnⅠ酶的降解）。與其他定點(diǎn)突變方法相比，一步法基因誘變法步驟簡(jiǎn)單、花費(fèi)低、效率高且成功率高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一步法基因誘變技術(shù)，成功將SCN5a基因序列上第310位的C誘變?yōu)門(mén)，使其蛋白質(zhì)序列上第104位的精氨酸（R）突變?yōu)樯彼幔╓），Western blotting法及膜片鉗記錄均證實(shí)R104W突變體符合轉(zhuǎn)運(yùn)障礙型突變的特征：與野生型SCN5a相比，R104W的蛋白表達(dá)與電流均降低，原因可能是突變引起蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，細(xì)胞膜上通道蛋白表達(dá)降低，從而降低了INa，并導(dǎo)致Brugada綜合征。

本研究采用一步法成功構(gòu)建pEGFP-SCN5a-R104W突變體，為后續(xù)探索R104W突變體的糾正方法研究奠定了基礎(chǔ)。

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