王虹蛟，孟威宏，王 強(qiáng)*，王心童，顏煒群，任立群

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·論著·

rhKD/APPvar對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力的影響

王虹蛟1，孟威宏2，王 強(qiáng)1*，王心童3，顏煒群4，任立群4

目的 探討重組人淀粉樣蛋白前體Kunitz型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域變異體(Reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant，rhKD/APPvar)對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力的影響。方法利用實(shí)驗(yàn)鼠的四氯化碳(CCl4)慢性肝損傷模型，采用免疫組化方法，檢測各組增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果正常對(duì)照組的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)為(2±2)個(gè)/視野，模型組的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)為(6±3)個(gè)/視野，rhKD/APPvar小、中、大劑量組的PCNA陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(29±110)個(gè)/視野、(38±10)個(gè)/視野、(55±12)個(gè)/視野，抑肽酶組的PCNA陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)為(24±9)個(gè)/視野，rhKD/APP組的PCNA陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)為(19±5)個(gè)/視野。與模型組相比，rhKD/APPvar各劑量組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加(P<0.05)，并且存在劑量依賴關(guān)系。rhKD/APPvar各劑量組陽性細(xì)胞數(shù)多于抑肽酶組。結(jié)論rhKD/APPvar能夠促進(jìn)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖，其作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)。

rhKD/APPvar；四氯化碳；急性肝損傷；小鼠；免疫組織化學(xué)

0 引言

肝損傷防治研究是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-6]。本文首先利用昆明小鼠建立四氯化碳(CCl4)肝損傷模型，然后用重組人淀粉樣蛋白前體中的Kunitz型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域變異體(Reorganization human KD/APP variant，rhKD/APPvar)進(jìn)行治療，通過免疫組織化學(xué)染色法觀察各組小鼠肝細(xì)胞的增殖能力，探討rhKD/APPvar對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70只健康昆明種小鼠，6～8周齡，雌雄各半，體重20～23 g。購自長春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究中心(動(dòng)物許可證：醫(yī)動(dòng)字第1055113)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠急性CCl4肝損傷模型的建立 將CCl4溶解于市售精制花生油中，配制濃度為0.1%(V/V)的CCl4油溶液。正常對(duì)照組按20 mL/kg劑量腹腔注射花生油，其他各組小鼠按20 mL/kg劑量腹腔注射0.1% CCl4油溶液。禁食不禁水。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 昆明種小鼠隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組(空白組)、CCl4中毒模型組(模型組)、rhKD/APPvar小、中、大劑量組及抑肽酶組、rhKD/APP組，每組10只?？瞻捉M和模型組腹腔注射等量生理鹽水；rhKD/APPvar小、中、大劑量組每天分別腹腔注射2、4、8萬KIU/kg的rhKD/APPvar,給藥7 d；抑肽酶組每天腹腔注射4萬KIU/kg抑肽酶，給藥7 d；rhKD/APP組每天腹腔注射4萬KIU/kg的rhKD/APP，給藥7 d。末次給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血，檢測血清中ALT、AST水平。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 末次給藥1 h后，處死小鼠，取肝大葉相同部位的肝組織,在10%福爾馬林中固定，按常規(guī)方法制作組織切片。①脫蠟與修復(fù)：石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟(二甲苯洗2次，每次30 min；無水乙醇洗2次，每次10 min；95%乙醇洗2次，每次5 min；80%乙醇洗1次，5 min)，蒸餾水洗2次之后，將切片置于枸櫞酸鹽修復(fù)液中，98 ℃加熱修復(fù)；②待切片冷卻至40 ℃以下之后，滴加3% H2O2，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育15 min之后，用PBS沖洗3次，每次5 min；③利用兔血清封閉，室溫孵育30 min，甩去多余血清；④滴加兔抗人PCNA抗體(1∶100稀釋)，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；⑤滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑥滴加三抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑦滴加DAB顯色1 min，用自來水中止發(fā)色；⑧蘇木素復(fù)染5 min，弱氨水返藍(lán)10 s，自來水沖洗；⑨脫水、透明及封片：80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ及100%乙醇Ⅱ脫水各5 min；二甲苯透明2次，每次5 min；樹膠封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 在200倍顯微鏡下，每張切片選取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCNA陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果 空白組的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)為(2±2)個(gè)/視野，模型組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)為(6±3)個(gè)/視野；rhKD/APPvar小、中、大劑量組的PCNA陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(29±11)個(gè)/視野、(38±10)個(gè)/視野、(55±12)個(gè)/視野；抑肽酶組PCNA陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)為(24±9)個(gè)/視野；rhKD/APP組PCNA陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)為(19±5)個(gè)/視野。rhKD/APPvar各劑量組的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著高于模型組(P<0.05)；rhKD/APPvar劑量越大，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目越多。提示rhKD/APPvar能夠促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，并存在劑量依賴關(guān)系。rhKD/APPvar各劑量組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)也多于抑肽酶組。

2.2 形態(tài)學(xué)結(jié)果 PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，rhKD/APPvar各劑量組肝組織中的PCNA陽性細(xì)胞增殖均較為活躍，其以rhKD/APPvar大劑量組的PCNA陽性細(xì)胞增殖最為活躍(圖1)。

圖1 肝細(xì)胞PCNA陽性細(xì)胞增殖形態(tài)(×200)

3 討論

目前國內(nèi)外多采用CCl4建立肝損傷模型[7-10]。CCl4主要經(jīng)呼吸道和消化道進(jìn)入體內(nèi)，導(dǎo)致肝臟損傷，這可能與CCl4自身和其自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)。CCl4進(jìn)入體內(nèi)后，生成代謝產(chǎn)物三氯甲基自由基(CCl3·)和氯自由基(Cl·)。CCl3·能夠與細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，生成脂肪酸，引起膜的脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生壞死[11]。CCl3·還抑制細(xì)胞膜和微粒體膜上鈣泵的活性，導(dǎo)致Ca2+離子內(nèi)流增加，最終引起細(xì)胞壞死。在缺氧條件下，CCl3·能引起多不飽和脂肪酸過氧化而導(dǎo)致肝細(xì)胞破裂。Samar等[12]發(fā)現(xiàn)CCl4引起的肝損害是通過自由基所誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的，自由基和環(huán)氧合酶介導(dǎo)的花生四烯酸產(chǎn)物的氧化與實(shí)驗(yàn)性的肝毒性密切相關(guān)。

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)只表達(dá)于正常的增殖細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞中，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)過程中具有重要作用，因此，PCNA是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)。本文通過檢測實(shí)驗(yàn)鼠肝組織中PCNA陽性細(xì)胞的數(shù)量，來評(píng)價(jià)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞的增殖能力。

淀粉樣蛋白前體中的Kunitz型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(KD/APP)是人Kunitz型蛋白酶抑制劑，具有強(qiáng)烈抑制絲氨酸蛋白酶的活性。本研究利用肝損傷的動(dòng)物模型，探討rhKD/APPvar對(duì)急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞增殖能力的影響。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞的PCNA表達(dá)水平，從而評(píng)價(jià)各組肝細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，rhKD/APPvar各劑量組的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)均多于模型組，隨著rhKD/APPvar劑量的增加，PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目也增加。說明rhKD/APPvar能夠促進(jìn)急性肝損傷肝細(xì)胞增殖，并存在劑量依賴關(guān)系。rhKD/APPvar各劑量組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)多于抑肽酶組和rhKD/APP組。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhKD/APPvar可以促進(jìn)PCNA陽性細(xì)胞的增殖，減輕急性肝損傷的程度，對(duì)小鼠急性CCl4肝損傷模型具有較好的保護(hù)性作用，為急性肝損傷的保護(hù)及治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of rhKD/APPvar on hepatocyte proliferation ability in mice with acute liver injury

WANG Hong-jiao1,MENG Wei-hong2,WANG Qiang1*,WANG Xin-tong3,YAN Wei-qun4,REN Li-qun4

(1.The 461 Hospital of PLA,Changchun 130021,China; 2.The General Hospital of Shenyang Military District,Shenyang 110016,China; 3.China-Japan Union Hospital,Jilin University,Jilin 130033,China; 4.The Institute of Frontier Medical Science,Jilin University,Jilin 130021,China)

Objective To study the effect of reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant (rhKD/APPvar) on hepatocyte proliferation ability in mice with experimental acute liver injury and provide theoretical basis for study on protective effect of rhKD/APPvar on acute liver injury.MethodsThe acute hepatic injury model of rats were induced by carbon tetrachloride (CCl4).Immunohistochemical method was used to observe the proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-positive cell number in various groups.ResultsThe positive cell number in control group was (2±2)/vision; (6±3)/vision in model group; (29±11)/vision,(38±10)/vision and (55±12)/vision in low,middle,and high dose rhKD/APPvar groups; (24±9)/vision in aprotinin group,(19±5) /vision in rhKD/APP group.The positive cell numbers in rhKD/APPvar group markely increased compared with model group(P<0.05),the positive cell number increased with the increase of rhKD/APPvar.The positive cell numbers in rhKD/APPvar groups were more than those in aprotinin group.ConclusionThe rhKD/APPvar could promote the proliferation of acute injured liver cells and the effect could be enhanced by titrating of rhKD/APPvar.

rhKD/APPvar; Carbon tetrachloride; Acute hepatic injury; Mice; Immunohistochemistry

2014-12-25

1.長春解放軍第461醫(yī)院，長春 130021；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，沈陽 110016；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 130033；4.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，吉林 130021

國家自然基金課題(30300153)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505001

*通信作者