洪彥濤， 張增艷

（中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學與遺傳育種重點實驗室，北京 100081）

利用熒光定量PCR檢測禾谷絲核菌的相對生物量

洪彥濤， 張增艷*

（中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學與遺傳育種重點實驗室，北京 100081）

小麥紋枯病是以禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染為主的小麥土傳病害。為建立檢測禾谷絲核菌在寄主小麥（Triticum aestivum）中的相對生物量的可靠方法，促進小麥抗紋枯病機制的研究，本研究克隆了禾谷絲核菌肌動蛋白基因RcActin的部分（3′端）cDNA，并設(shè)計了RcActin的特異引物。該引物不僅能區(qū)分禾谷絲核菌與寄主小麥，還能區(qū)分全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、根腐病菌（Bipolarissorokiniana）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等常見小麥土傳病害的病原菌，表明該引物能用于小麥紋枯病的分子檢測，也能用于相對表達量的測定。利用相對定量法，以RcActin相對于寄主管家基因的相對表達量作為禾谷絲核菌相對生物量的指標，結(jié)果表明，此方法能準確反映禾谷絲核菌在寄主中的相對生物量和對小麥紋枯病抗性程度進行快速鑒定。

小麥紋枯??； 禾谷絲核菌； 肌動蛋白； 相對表達量； 生物量

小麥紋枯病又稱小麥尖眼點病（wheat sharp eyespot），是小麥重要土傳病害。我國小麥紋枯病主要由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染所引起［1］。禾谷絲核菌屬于絲核菌屬（Rhizoctonia）雙核絲狀真菌，不產(chǎn)生無性孢子，通過侵染小麥（Triticum aestivum）的葉鞘和莖部，引起小麥組織壞死，形成褐色云紋花稈狀病斑［2］。嚴重情況下病株會因養(yǎng)分、水分供應(yīng)不足而造成枯白穗［3］。近年來，紋枯病已經(jīng)成為國內(nèi)小麥生產(chǎn)的主要病害，造成嚴重的經(jīng)濟損失，如2005年我國小麥紋枯病發(fā)生面積就達到54萬hm2，造成至少8萬t的產(chǎn)量損失［4］，可見紋枯病對我國糧食安全構(gòu)成潛在威脅。因此，開展小麥抗紋枯病育種和小麥－禾谷絲核菌互作機制的研究迫在眉睫。

病原物的鑒定和定量檢測對于病害管理和寄主－病原菌互作機制研究十分重要。傳統(tǒng)方法主要基于形態(tài)學特性和致病力鑒定，費時費力，并且無法進行定量分析。傳統(tǒng)的紋枯病抗性鑒定方法基于肉眼對病斑大小進行分級［5］，各病級之間界限不明顯，不同人判斷時容易造成差異。相較于傳統(tǒng)方法，實時熒光定量PCR（qPCR）因其靈敏度高、結(jié)果快速準確，在病原菌鑒定及生物量測定方面受到越來越多的關(guān)注［6-9］。寄主體內(nèi)病原物的生物量是寄主抗病或者感病程度的一個考量，也是病原物侵染程度的一個反映［10-13］。目前，檢測病原物生物量的方法有兩種：1）絕對定量，即通過病原物在寄主中的DNA含量來反映其生物量［10-11］。首先將病原菌的基因組DNA梯度稀釋后進行qPCR，根據(jù)Ct值和DNA濃度的關(guān)系制定標準曲線，然后對發(fā)病組織定量取樣進行DNA提取，再進行qPCR，將所得到的Ct值代入標準曲線則可以得到病原物的DNA含量［14］。2）相對定量，即通過檢測病原物相關(guān)基因的表達水平反映其生物量［12-13，15-16］。一般以寄主的管家基因作為內(nèi)標，通過檢測病原菌管家基因（如18S rRNA基因［12-13］和肌動蛋白基因［15-16］）的表達量來反映病原菌的生物量。相對定量測定法的優(yōu)勢在于除了能反映病原菌的生物量外，還能檢測寄主發(fā)病部位的其他基因表達量。

肌動蛋白（Actin）是細胞骨架的重要組成蛋白［17］。Actin基因為重要的管家基因，一般為組成型表達，因此常被作為基因表達分析的內(nèi)參基因［18］。一些病原菌的Actin基因表達量也被用來檢測病原物的生物量，如灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）［15］和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）［16］。目前，禾谷絲核菌的Actin基因還未得到克隆，也未有用相對定量的方法檢測禾谷絲核菌相對生物量的報道。本研究克隆了禾谷絲核菌Actin基因RcActin3′端cDNA，并通過檢測RcActin表達量分析檢測禾谷絲核菌的相對生物量。結(jié)果表明，禾谷絲核菌Actin基因相對于寄主管家基因的相對表達量能反映該病原菌在寄主組織中的相對生物量和寄主的抗病程度。同時這種方法還可以用來檢測其他基因在發(fā)病部位的表達情況。相對于絕對定量，該方法簡便易行，更適合用于不同抗性材料間抗病和感病程度的比較。

1 材料和方法

1.1 材料

小麥品種或品系：‘CI12633’，‘山紅麥’，‘Navit14’，‘山農(nóng)0431’，‘揚麥158’，‘溫麥6號’，‘周麥16號’和‘周麥18號’作為檢測引物特異性的材料，‘CI12633’和‘溫麥6號’作為接菌材料用于禾谷絲核菌Actin基因表達量檢測。小麥紋枯病病原菌—禾谷絲核菌R0301由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植保所陳懷谷研究員提供，小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）XNQS-2由西北農(nóng)林科技大學植物保護學院王陽副教授提供，根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）ACC30209由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所李洪杰惠贈。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）由本實驗室保存。病原菌在PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 接菌方法

參照蔡士賓等［19］的方法，將禾谷絲核菌R0301菌絲塊移植到新的PDA固體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)10 d，進行活化。將牙簽剪成兩段，再劈成兩半，用清水清洗后裝在燒杯中。往燒杯里加適量的PDA液體培養(yǎng)基，高壓高溫滅菌。將活化后的菌絲塊放到滅過菌的牙簽里，25℃培養(yǎng)30 d。待小麥拔節(jié)之后，將布滿菌絲的牙簽嵌入小麥葉鞘和莖部之間，使牙簽頂部與莖節(jié)處齊平，在外層包裹一層脫脂棉，噴水保濕5 d。

莖部病斑大?。╨esion size）測量：測量每個病斑縱向長度（L cm）和病斑弧長占莖周長的比例（R）。lesion size＝L×R。如果莖部有多個病斑，計算每個病斑后累加。

1.3 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

分別從接種禾谷絲核菌0、12 h，1、2、4和7 d的小麥葉鞘和莖部取樣，取樣時用酒精棉球擦去小麥組織表面殘留的接菌菌絲，再剪下接病部位的莖節(jié)以下6 cm的莖部和葉鞘，用錫箔紙包裹后液氮凍存，－80℃保存。

用Trizol（Invitrogen）法進行RNA提取，用DNaseⅠ（TaKaRa）去除基因組DNA。利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa），以O(shè)ligo d T為引物反轉(zhuǎn)錄、合成單鏈cDNA。

1.4 禾谷絲核菌Actin基因3′端cDNA的克隆和特異引物設(shè)計

用小麥Actin基因Ta Actin的引物（TaAct A：5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′/TaActB：5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′），以禾谷絲核菌cDNA為模板進行擴增。擴增條件為：94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。回收目的擴增帶并克隆到pMD-18T（TaKaRa）載體后，進行測序。得到禾谷絲核菌Actin基因的片段。根據(jù)所獲得的禾谷絲核菌Actin基因的特異片段設(shè)計用于3′RACE（rapidamplification of cDNA ends）的引物RC-ACT-3RACE：5′-TCTTCCCGTCCATTGTCG-3′。

利用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）ver.3.0（TaKaRa）進行禾谷絲核菌Actin基因3′RACE。以提取的禾谷絲核菌總RNA為模板，以O(shè)ligo d TAdaptor：5′-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′為起始引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）進行cDNA第一鏈合成。以RC-ACT-3RACE和M13M-4：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′作為引物進行擴增。反應(yīng)體系為50μL：包含10 ×LATaqPCR buffer 5μL，2.5 mol/L dNTP 4μL，10 pmol/L引物各2μL，cDNA模板2μL，LATaq聚合酶（TaKaRa）0.5μL。反應(yīng)程序為：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將回收的目的帶克隆到p MD-18T載體后雙向測序。

用Primer 5.0進行引物設(shè)計，為保證引物的特異性，將上游引物設(shè)計在編碼區(qū)，下游引物設(shè)計在3′UTR。引物序列為：Rc Actin-F：5′-GCATCCACGAGACCACTTAC-3′和Rc Actin-R：5′-GCGTCCCGCTGCTCAAGAT-3′。所設(shè)計的引物再經(jīng)NCBI Primer BLAST（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast/）進行特異性檢測。

1.5 實時定量RT-PCR（qPCR）檢測

用天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進行實時定量RT-PCR。反應(yīng)體系25μL。包含12.5μL的2×SuperReal Premix，引物（10 pmol/L）各0.75μL，5μL cDNA模板和0.5μL 50×ROX Reference Dye。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s，61℃退火31 s，41個循環(huán)。用2－ΔΔCt方法［20］計算目標基因的相對表達量。以小麥Actin基因TaActin作為內(nèi)參基因。以抗病相關(guān)基因TaPR1a的表達量來檢測寄主對病原菌的反應(yīng)，TaPR1aqPCR引物序列參照文獻［12］。每個處理進行3次重復(fù)，每個樣品qPCR檢測時進行3個技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷絲核菌Actin基因的cDNA 3′端的克隆

基于Actin基因在不同物種中的功能及序列保守性，利用小麥特異Actin基因引物，以禾谷絲核菌cDNA為模板，48℃退火溫度擴增出約200 bp的片段。通過測序后得到禾谷絲核菌Actin基因的特異片段。以該特異片段為起始序列，以禾谷絲核菌RNA為模板進行3′RACE擴增，得到約1.2 kb的片段。經(jīng)測序和比對分析表明，所獲得序列為禾谷絲核菌特異的Actin基因序列。編碼區(qū)預(yù)測表明，該序列包含1 070 bp的部分編碼區(qū)和210 bp的3′非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR），將該序列命名為RcActin，GenBank登錄號為KJ631110。RcActin與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-3的Actin基因Gen-Bank登錄號EVC56270有83%的一致性，編碼的蛋白序列有99%的相似性。

2.2RcActin特異引物設(shè)計

根據(jù)RcActin序列，設(shè)計了特異引物用于檢測RcActin的表達量。該對引物以禾谷絲核菌cDNA為模板可擴增出329 bp的片段（圖1a）；以禾谷絲核菌基因組DNA為模板可擴增得到436 bp的片段（圖1b）?；厥諟y序后發(fā)現(xiàn)，該436 bp的片段為RcActin的基因組部分序列，包含了2個內(nèi)含子，表明該引物也可以用于禾谷絲核菌基因組DNA的檢測。

為檢測所設(shè)計引物的特異性，以不同品種或者品系的小麥、幾種常見的小麥土傳病害病原菌（G.graminis，B.sorokiniana，R.solani）和禾谷絲核菌的cDNA為模板，進行擴增。從圖1a可以看出，只有禾谷絲核菌cDNA可以擴增出目的條帶（329 bp），而健康小麥和其他3種病原菌cDNA中未擴增出片段（圖中只顯示小麥‘CI12633’的結(jié)果）。另外，以上述病原菌的基因組DNA為模板進行擴增，以真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）通用引物作為對照，結(jié)果如圖1b所示，該引物只能從禾谷絲核菌基因組DNA中擴增出目的條帶（436 bp），而采用ITS通用引物均能擴增出條帶。以上結(jié)果表明該引物是禾谷絲核菌特異的，可以區(qū)別寄主小麥和其他幾種常見小麥土傳病害病原菌。

2.3 相對定量能反映禾谷絲核菌的生物量變化

為了檢測上述引物Rc Actin-F/Rc Atin-R是否能從受禾谷絲核菌侵染的小麥組織中擴增到目的片段，分別以未接種和接種禾谷絲核菌的小麥葉鞘組織的cDNA為模板進行RcActin的擴增。結(jié)果顯示，該引物在感染禾谷絲核菌的小麥組織中可以擴增出單一的Rc Actin目的條帶，而在未接種的小麥組織中沒有擴增到該目的條帶（圖2），說明該引物可以用于qPCR檢測。

圖2RcActin基因在發(fā)病部位的表達Fig.2RcActinexpressed in the infected tissue of host

為分析禾谷絲核菌在侵染小麥后的擴展程度，以小麥的Actin基因Ta Actin為內(nèi)標，利用qPCR分析了RcActin在接菌后不同時間點在寄主體內(nèi)的表達量（以下所有RcActin表達量的表述都是以小麥Actin基因Ta Actin為內(nèi)標的表達量）。qPCR結(jié)果顯示，RcActin在侵染點的表達量隨侵染時間的推移而逐漸增加。在葉鞘組織中，RcActin在接種12 h后就能檢測到，而且它的表達模式在接種后0～7 d內(nèi)呈S形曲線增加（圖3a）。而在莖部組織中，RcActin在接種1 d后才可檢測到，說明葉鞘相對于莖部更容易受禾谷絲核菌的侵染，而且RcActin在莖部的表達模式呈J形增長（圖3b）。禾谷絲核菌侵入寄主細胞后會在受侵細胞內(nèi)網(wǎng)狀擴展，并逐漸向相鄰細胞縱橫擴展增殖［21］，其生物量在寄主體內(nèi)逐漸增加。RcActin表達量相對于0 h逐漸增加與禾谷絲核菌在寄主組織的擴展是相一致的。說明RcActin表達量變化可以反映侵入植物組織中禾谷絲核菌生物量的變化。另外qPCR的結(jié)果顯示，雖然在接種早期（12 h～4 d）寄主小麥還未出現(xiàn)病斑，但已能檢測到RcActin的表達，表明此方法也可以用于小麥紋枯病的早期診斷。

另外，分析了抗病相關(guān)的基因TaPR1a［12］在禾谷絲核菌侵染葉鞘中的表達量變化。從圖3c可以看出，隨著禾谷絲核菌生物量的增加，TaPR1a表達量逐漸上升，表明TaPR1a受禾谷絲核菌誘導(dǎo)表達。

2.4 利用熒光定量PCR對小麥紋枯病抗性進行鑒定

寄主被病原菌侵染后產(chǎn)生病斑的大?。╨esion size）是寄主抗病性的一個指標，病斑越小表明寄主體內(nèi)的病原菌生物量越少，抗性越好。通過選取紋枯病病斑大小不同的發(fā)病植株，并對莖部發(fā)病部位取樣，檢驗RcActin的相對表達量與紋枯病抗性程度的關(guān)系。從圖4a中可以看出，病斑大小與RcActin表達量呈正相關(guān)，即病斑大的部位，RcActin表達量也高。另外，以接種禾谷絲核菌的抗紋枯病小麥‘CI12633’和感病小麥‘溫麥6號’為材料，分析了接種該病菌不同時段RcActin的表達量。結(jié)果如圖4b所示，接種禾谷絲核菌2 d和4 d后，RcActin的表達量在兩種小麥中沒有差異，但在接種后7、14和21 d，RcActin在‘溫麥6號’中的表達量顯著高于在‘CI12633’中的表達量，這與兩個小麥材料的紋枯病抗性是相對應(yīng)的，表明用熒光定量PCR對禾谷絲核菌相對生物量進行檢測是可靠的。以上結(jié)果還表明，能通過相對定量的方法對寄主的紋枯病抗性程度進行快速鑒定。

圖3 接種禾谷絲核菌后不同時間RcActin和TaPR1a的qPCR分析Fig.3 Quantitative real-time PCR analysis ofRcActinandTaPR1aafter inoculation ofR.cerealis

圖4RcActin的表達量和寄主對紋枯病抗性的關(guān)系Fig.4 Relationship between expression ofRcActinand resistant degree againstR.cerealisin wheat

3 討論

之前對禾谷絲核菌生物量的測定都是通過絕對定量測定病原物DNA的含量［22-23］。比如，Nicholson等［22］利用禾谷絲核菌特異的隨機擴增多態(tài)性標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）引物通過競爭PCR對禾谷絲核菌進行定量測定。Gao等［23］利用禾谷絲核菌微管蛋白（tubulin）基因通過qPCR對土壤中的禾谷絲核菌進行檢測和定量。但絕對定量對DNA質(zhì)量要求很高（低質(zhì)量DNA會影響DNA濃度的測定），另外每次檢測時都需要重新制備標準曲線。而相對定量在病原菌生物量的平行比較方面能更簡便快速。目前已有許多例子成功運用相對定量檢測病原菌的相對生物量。比如，Liu等［12］通過分析全蝕病菌的18S基因在寄主根部的表達量來檢測全蝕菌的相對生物量，從而分析轉(zhuǎn)基因小麥對全蝕病的抗性。Mengiste等［24］通過RT-PCR檢測灰葡萄孢菌Tubulin基因在寄主中的相對表達量來鑒定寄主對病原菌的抗性。然而，有關(guān)禾谷絲核菌相對生物量定量分析還未見報道，本研究首次通過基因表達水平來反映禾谷絲核菌相對生物量。

Actin基因為重要的管家基因，常被選為內(nèi)參基因［18］，同時也被用來反映病原菌生物量。比如，Chacón等［16］利用立枯絲核菌的Actin基因來對該病原菌的相對生物量進行測定。Abuqamar等［15］通過RT-PCR檢測灰葡萄孢菌Actin基因的表達量來反映該病原菌在寄主體內(nèi)的增殖和寄主對該病原菌的抗性。本研究利用3′RACE首次克隆到禾谷絲核菌Actin基因RcActin的部分編碼區(qū)和3′UTR，雖然未得到其全長cDNA，但足以用來設(shè)計RcActinqPCR特異引物。

引物的特異性是qPCR成功與否的關(guān)鍵因素。本研究所設(shè)計的RcActinqPCR引物特異性強，能將禾谷絲核菌與寄主小麥區(qū)分開來，還能區(qū)分全蝕病菌、根腐病菌和立枯絲核菌等常見小麥土傳病害的病原菌。另外該引物也能從禾谷絲核菌基因組DNA中擴增出特異片段，說明該引物也能夠用于小麥紋枯病的分子檢測。

研究禾谷絲核菌在小麥體內(nèi)的擴展對小麥－禾谷絲核菌互作機制研究具有重要的意義。通過相對定量能直觀地體現(xiàn)禾谷絲核菌在寄主體內(nèi)擴展和生物量的變化。本研究結(jié)果顯示，RcActin的表達量變化可以用來反映禾谷絲核菌在寄主體內(nèi)的生物量變化。研究表明在受侵染的葉鞘組織中，接種12 h后禾谷絲核菌可能就能侵入到葉鞘細胞中，而且RcActin表達量的變化在接種0～7 d內(nèi)呈S形增長，故該病原菌在寄主體內(nèi)生物量的增長也可能為S形曲線增長。而在莖部組織中，相對于葉鞘禾谷絲核菌入侵到寄主細胞則較晚，在接種0～7 d內(nèi)RcActin表達量的變化呈J形增長，說明葉鞘組織相對莖部更容易受禾谷絲核菌侵染。相對定量還可以同時分析其他基因的表達量。本研究結(jié)果顯示，TaPR1a隨著禾谷絲核菌生物量的增加表達量逐漸上調(diào)。這結(jié)果與之前的報道類似：灰葡萄孢菌侵染番茄葉片后，隨著病原菌的擴展，寄主的PR-1的表達量也逐漸上升［25］。

通過檢測禾谷絲核菌在小麥體內(nèi)的相對生物量能對小麥的紋枯病抗性進行快速鑒定。本研究結(jié)果顯示，RcActin的相對表達量與受侵染寄主的紋枯病病斑成正相關(guān)。另外，在接種禾谷絲核菌7 d后，RcActin的表達量在感紋枯病小麥‘溫麥6號’和抗病小麥‘CI12633’體內(nèi)的生物量就產(chǎn)生了差異——禾谷絲核菌生物量在‘溫麥6號’中顯著高于‘CI12633’。在發(fā)病后期（14 d和21 d）兩者的差異則更大。表明用相對定量進行禾谷絲核菌生物量檢測是可靠的，而且能用于抗病性的早期鑒定和后期驗證。

本研究利用qPCR檢測禾谷絲核菌的相對生物量來反映病原菌在寄主的擴展和寄主對其的抗病程度，能為小麥抗紋枯病育種和小麥－禾谷絲核菌互作機制的研究提供思路和方法，幫助人們更好地認識禾谷絲核菌和小麥紋枯病。

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Relative quantification of biomass ofRhizoctonia cerealisusing real-time PCR

Hong Yantao， Zhang Zengyan
（National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of
Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops，Ministry of Agriculture/Institute of
Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081，China）

Wheat sharp eyespot，caused byRhizoctonia cerealis，is a devastating soil-borne disease.In order to quantify the relative biomass ofR.cerealisand propel the study about mechanism of resistance of wheat againstR.cerealis，we had cloned the partial cDNA of actin gene fromR.cerealis（named asRcActin）.Then the specific primers ofRcActinwere designed for diagnosis of sharp eyespot and expression analysis ofRcActin.The primers could specifically distinguishR.cerealisfrom wheat，Gaeumannomyces graminis，Bipolaris sorokinianaandRhizoctonia solani.We had proofed that theRcActinexpression level can be used as an indicator of the fungal relative biomass and evaluation of resistant degree againstR.cerealisin wheat.

wheat sharp eyespot；Rhizoctonia cerealis； actin； relative expression； biomass

S 432.1

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.022

2014 02 17

2014 05 28

國家自然科學基金（31271799）

*通信作者 Tel：010 82108781；E-mail：zhangzengyan@caas.cn