，，，，，

（1.廣西柳州市柳北區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 柳州 545002；2.廣西柳州市柳北區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西 柳州 545002；3.廣西柳州市柳北區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西 柳州 545002；4.廣西柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 柳州 545005）

禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗與重組禽流感滅活疫苗組合免疫效果觀察

楊飛燕1，劉 穎1，張 廉1，陸成春2，雷 振3，許宗麗4

（1.廣西柳州市柳北區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 柳州 545002；2.廣西柳州市柳北區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局，廣西 柳州 545002；3.廣西柳州市柳北區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西 柳州 545002；4.廣西柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 柳州 545005）

為進(jìn)一步了解、掌握禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗及與重組禽流感滅活疫苗組合使用的免疫效果，本研究以麻花雞作為試驗(yàn)對(duì)象，制定了4種不同的免疫程序，分別對(duì)4組試驗(yàn)雞群進(jìn)行免疫，通過(guò)測(cè)定各組雞只產(chǎn)生的免疫抗體效價(jià)和免疫抗體合格率，以評(píng)價(jià)二聯(lián)活疫苗及與禽流感滅活疫苗的免疫效果。試驗(yàn)結(jié)果表明：禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗單獨(dú)用于肉雞禽流感H5免疫預(yù)防抗體效價(jià)低于4 log2；建議禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗可以與重組禽流感病毒滅活疫苗組合使用，兩種疫苗免疫時(shí)間間隔2周左右，以免抑制機(jī)體產(chǎn)生對(duì)新城疫的免疫應(yīng)答。

禽流感；新城疫；重組二聯(lián)活疫苗；重組禽流感滅活疫苗；抗體效價(jià)；抗體合格率

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的A類(lèi)傳染病中，禽類(lèi)烈性傳染病只有兩種，分別是高致病性禽流感和新城疫[1]。使用禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗可一次完成高致病性禽流感和新城疫的免疫，收到一種疫苗預(yù)防兩種重大疫病的效果。禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗是以新城疫Lasota弱毒病毒為載體，將禽流感H5的HA基因片段插入到Lasota載體中制作的疫苗，是更為新型的負(fù)鏈RNA病毒活載體疫苗，其生產(chǎn)技術(shù)在國(guó)際上具有領(lǐng)先水平[2]。

目前在基層動(dòng)物防疫，特別是在農(nóng)村散養(yǎng)戶家禽防疫中普遍使用的禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗方便、省事，很受村級(jí)動(dòng)物防疫員和農(nóng)戶的歡迎。但按照該疫苗的使用說(shuō)明，生產(chǎn)實(shí)踐中單獨(dú)使用該疫苗所取得的禽流感免疫效果并不理想。2012年柳州市重大動(dòng)物疫病防控驗(yàn)收工作時(shí)，特意挑選轄區(qū)內(nèi)2個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)2個(gè)村屯共20只二次免疫了禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗的散養(yǎng)家禽，供采血檢測(cè)禽流感和新城疫抗體。結(jié)果顯示禽流感平均免疫抗體為＜1log2，平均合格率為0；新城疫平均免疫抗體為7log2，平均合格率為85%。為了進(jìn)一步了解、掌握單獨(dú)使用禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗的免疫效果，以及與禽流感滅活疫苗聯(lián)合使用的免疫效果，本研究以麻雞作為試驗(yàn)對(duì)象，制定4種不同免疫程序，分別用于4組試驗(yàn)雞群。通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)觀察、抗體效價(jià)檢測(cè)、抗體合格率等參數(shù)，以評(píng)價(jià)二聯(lián)活疫苗及與禽流感滅活疫苗的實(shí)際免疫效果，探索免疫方案，指導(dǎo)免疫工作，為禽流感、新城疫的預(yù)防和控制工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)疫苗 禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）（AI-ND），哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，生產(chǎn)批號(hào)2013111；重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型Re-6株）（AI），廣東永順生物制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)2013045；新城疫滅活油乳劑疫苗（ND），廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)190032008。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 15日齡麻花雞，由柳州市柳北區(qū)順發(fā)禽苗經(jīng)營(yíng)部提供。

1.1.3 診斷試劑 哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)的禽流感H5（Re-6）株抗原，批號(hào)2013003，有效期2年；禽流感H5陽(yáng)性血清，批號(hào)2013002，有效期2年；哈爾濱生物制品國(guó)家工程研究中心有限公司生產(chǎn)的新城疫抗原，批號(hào)14M001，有效期2年；新城疫陽(yáng)性血清，批號(hào)14M001，有效期2年；紅細(xì)胞懸液采自農(nóng)戶非免疫雞血清，按常規(guī)方法制備成1%懸液。

1.1.4 其它藥品器材 5g/L滅菌生理鹽水、抗凝劑、微量移液器、離心機(jī)、96孔V型板等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方案 本次試驗(yàn)于2014年3月-6月在柳州市柳北區(qū)順發(fā)禽苗經(jīng)營(yíng)部提供的養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組又分4個(gè)小組，每組40只雞，分別圈養(yǎng)（表1）。

表1試驗(yàn)方案

1.2.2 血清樣本采集 疫苗接種后以一定間隔時(shí)間每組隨機(jī)采樣10～12份，檢測(cè)禽流感H5和新城疫抗體。禽流感H5抗體按照GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)-血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)；新城疫抗體按照GB16550-2008新城疫診斷技術(shù)-血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞群免疫后應(yīng)激反應(yīng)情況 試驗(yàn)1組、2組、3組應(yīng)激反應(yīng)較輕，僅僅表現(xiàn)為采食量減少，2～3d后就恢復(fù)正常；試驗(yàn)4組應(yīng)激反應(yīng)較大，表現(xiàn)為采食量減少，少部分雞只食欲不振，腳軟，死亡率5%左右。

2.2 各組試驗(yàn)雞抽樣檢測(cè)禽流感H5抗體和新城疫抗體效價(jià)（表2、表3和圖1、圖2）。

表2 禽流感H5抗體合格率和抗體效價(jià)（單位：%、log2）

表3新城疫抗體合格率和抗體效價(jià)（單位：%、log2）

圖1 各組禽流感H5抗體效價(jià)對(duì)比圖

圖2 各組新城疫抗體效價(jià)對(duì)比圖

2.3 試驗(yàn)1組中二次免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗，結(jié)果表明：二聯(lián)活疫苗刺激肉雞產(chǎn)生的禽流感H5抗體效價(jià)和抗體合格率均較低，最高分別只有1.6 log2和20%，達(dá)不到有效保護(hù)；新城疫抗體效價(jià)和抗體合格率則較高，峰值達(dá)到7.3log2和100%，但維持時(shí)間較短。這與我們2012年重大動(dòng)物疫病防控驗(yàn)收抽檢的20只散養(yǎng)戶家禽的抗體效價(jià)基本一致（圖1、圖2、圖3）。其原因不得而知，據(jù)有關(guān)資料介紹：禽流感病毒和新城疫病毒均具有血凝素，且均為保護(hù)性抗原，在同一個(gè)載體上同時(shí)具有兩種血凝素抗原需要結(jié)合到受體位點(diǎn)上，即在免疫應(yīng)答時(shí)是否存在兩種血凝素抗原位點(diǎn)需要競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合血凝素受體位點(diǎn)，而新城疫的血凝素受體位點(diǎn)借助于自身病毒空間結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，比禽流感的H5血凝素結(jié)合受體位點(diǎn)更具有優(yōu)勢(shì)[3]。

2.4 試驗(yàn)2組中第一次免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗，第二次分別免疫重組禽流感病毒滅活苗和新城疫油苗。結(jié)果表明：二次免疫后7天即37日齡就開(kāi)始產(chǎn)生禽流感抗體效價(jià)，45日齡達(dá)到峰值9.1log2，并能維持一個(gè)月左右時(shí)間的較高抗體滴度，抗體合格率也隨著抗體效價(jià)的升高而升高，最高達(dá)到100%；二次免疫新城疫油苗后1周抗體效價(jià)會(huì)有所下降，之后就持續(xù)上升，最高抗體效價(jià)于63日齡出現(xiàn)，為8.4log2，維持時(shí)間也較長(zhǎng)?？贵w合格率于45日齡達(dá)到100%，之后一直維持高抗體合格率（圖1、圖2、圖4）。滅活疫苗具有比較穩(wěn)定及誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平均一等優(yōu)點(diǎn)，但其存在接種后產(chǎn)生應(yīng)答的潛伏期相對(duì)較長(zhǎng)，成本偏高等不足[1]。本組試驗(yàn)雞分別接種禽流感滅活疫苗和新城疫油苗，都產(chǎn)生了較高水平且均一的抗體效價(jià)，進(jìn)一步驗(yàn)證了滅活疫苗比較穩(wěn)定、誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平均一等優(yōu)良的特性。

2.5 試驗(yàn)3組中第一次免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗，第二次免疫重組禽流感病毒滅活苗。結(jié)果表明：禽流感抗體滴度與試驗(yàn)2組基本一致，峰值達(dá)到8.8 log2，并能維持較長(zhǎng)時(shí)間，抗體合格率也較高。新城疫抗體滴度于37日齡達(dá)到峰值6.8 log2，之后就緩慢下降，53日齡后低于5 log2，維持時(shí)間較短，抗體合格率也于53日齡后降到70%以下（圖1、圖2、圖5）。

2.6 試驗(yàn)4組中第一次和第二次都是同時(shí)免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗和重組禽流感病毒滅活苗。結(jié)果表明：禽流感抗體滴度于第一次免疫后1周即22日齡呈緩慢上升趨勢(shì)，到第二次免疫日齡即30日齡時(shí)平均抗體滴度達(dá)到3.5 log2，二免后2周即45日齡達(dá)到峰值7.9 log2，并能維持較長(zhǎng)時(shí)間。抗體合格率37日齡后達(dá)到100%，最低也能達(dá)到70%以上；新城疫抗體效價(jià)卻很低，最高也只有4.3 log2，平均抗體合格率33%，達(dá)不到國(guó)家對(duì)新城疫免疫的要求（圖1、圖2、圖6）。試驗(yàn)結(jié)果與司興奎等[4]研究的結(jié)論基本一致，重組禽流感滅活苗與禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗同時(shí)接種可抑制機(jī)體產(chǎn)生對(duì)新城疫的免疫應(yīng)答，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

圖3 試驗(yàn)1組禽流感抗體效價(jià)和新城疫抗體效價(jià)結(jié)果比較

圖4 試驗(yàn)2組禽流感抗體效價(jià)和新城疫抗體效價(jià)結(jié)果比較

圖5 試驗(yàn)3組禽流感抗體效價(jià)和新城疫抗體效價(jià)結(jié)果比較

圖6 試驗(yàn)4組禽流感抗體效價(jià)和新城疫抗體效價(jià)結(jié)果比較

3 小結(jié)與討論

3.1 本試驗(yàn)用禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）單獨(dú)免疫，以及與重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型Re-6株）組合采用不同的免疫方法接種商品肉雞，結(jié)果提示，禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）單獨(dú)用于肉雞禽流感H5免疫預(yù)防抗體效價(jià)低于4 log2。據(jù)有關(guān)資料介紹，禽流感最低保護(hù)臨界值為4 log2-6 log2之間，且必須大于4 log2[5]，重組二聯(lián)苗免疫保護(hù)的臨界值為3 log2左右[6]。如果雞群抗體效價(jià)長(zhǎng)期低于4 log2，就不能實(shí)現(xiàn)有效保護(hù)。有研究以雞痘病毒為載體表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA基因的重組疫苗接種SPF雞的試驗(yàn)結(jié)果免疫后抗體滴度也較低，但通過(guò)攻毒試驗(yàn)，仍能夠抵御同亞型禽流感病毒的致死性攻擊，保護(hù)效果達(dá)到或優(yōu)于滅活苗[7]。禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）是否也存在這種情況，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。限于實(shí)際條件，未能開(kāi)展強(qiáng)毒攻擊保護(hù)試驗(yàn)，對(duì)此需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 根據(jù)本次試驗(yàn)的結(jié)果，建議禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）與重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型Re-6株）組合使用，以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)禽流感的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。但兩種疫苗免疫時(shí)間最好間隔2周左右，以免抑制機(jī)體產(chǎn)生對(duì)新城疫的免疫應(yīng)答。

3.3 本次試驗(yàn)中禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）免疫后產(chǎn)生的新城疫抗體迅速、效價(jià)較高，但維持時(shí)間不長(zhǎng)，這也驗(yàn)證了活疫苗免疫后群體抗體水平不均一和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)的特性。建議在臨床生產(chǎn)中禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）做新城疫基礎(chǔ)免疫后，間隔一段時(shí)間后要加強(qiáng)新城疫的免疫，以保證確切的新城疫免疫效果。

[1] Saif YM，et al//蘇敬良，高福，索勛，等譯.禽病學(xué)[M].第11版.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：66-93，147-177.

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Analysis of Immune Effects of Recombinant Live AI-ND Vaccine and Recombinant Inactivated AI Vaccine in Chickens

Yang Feiyan1，Liu Ying1，Zhang Lian1，Lu Chengchun2，Lei Zhen3，Xu Zongli4Liubei Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545002；2. Liubei Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Liuzhou，Guangxi 545002；3. Liubei Animal Health Supervision Institute，Liuzhou，Guangxi 545002；4. Liuzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545005）

In order to compare the immune results of recombinant live avian inf uenza and Newcastle disease（AIND） and recombinant inactivated avian inf uenza vaccine（AI） in chickens，4 different immunization procedures were conducted respectively over 4 test groups for evaluation of immune effects of recombinant live AI-ND vaccine and recombinant inactivated AI vaccine through examination of immune antibody titer and yield in the 4 test groups. The test results showed that：when the recombinant live AI-ND vaccine was used alone，the H5 AI immune antibody titer in broilers was less than 4log2. It was recommended that live AI-ND vaccine and inactivated AI vaccine should be used in combination with 2 weeks interval without inhibiting the immune response to Newcastle disease vaccine.

avian influenza；Newcastle disease；recombinant live AI-ND vaccine；recombinant inactivated AI vaccine；antibody titer；antibody qualif cation rate

S852.65

：B

：1005-944X（2015）01-0074-05