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（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

H5N6亞型禽流感病毒反向遺傳疫苗株的構(gòu)建及免疫保護(hù)試驗

蔣文明，侯廣宇，王素春，李金平，劉 朔，陳繼明

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

為應(yīng)對抗原性已發(fā)生變異的第2.3.4.6分支H5N6亞型禽流感病毒（AIV）引發(fā)的潛在流行，本研究利用反向遺傳操作技術(shù)，以A/Puerto Rico/8/34（PR8）的內(nèi)部基因為骨架，以H5N6亞型AIV A/Chicken/SC/6/2014（C6）的基因組為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增其HA及NA基因，并對HA基因進(jìn)行分子修飾，去除與H5亞型AIV致病力有關(guān)的HA蛋白裂解位點處的多個堿性氨基酸，使其獲得低致病性AIV的分子特征（即將-PLRERRRKR-突變?yōu)?PQRETR-），成功構(gòu)建了H5N6亞型AIV疫苗候選株rC6。免疫效力試驗表明，rC6重組滅活疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的血凝抑制抗體。免疫攻毒保護(hù)試驗表明，rC6重組滅活疫苗可以提供SPF雞抵抗同源和異源H5N6病毒100%的保護(hù)，而針對第2.3.4分支的Re-5疫苗僅能提供大約10%的保護(hù)。利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的rC6重組疫苗候選株為該分支病毒的防控提供了有益的嘗試。

禽流感病毒；變異株；H5N6；反向遺傳；疫苗

2003年以來，H5N1亞型高致病性禽流感（Avian inf uenza，AI）一直在多個國家和地區(qū)流行，不但給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著人類的健康。除了不斷加強和完善流感監(jiān)測以外，接種疫苗仍然是防控AI的重要手段。而疫苗的有效性則取決于疫苗株與流行株之間的抗原性匹配程度[1]。2005年，我國推出了針對第2.3.4分支的Re-5疫苗，有效地控制了該分支病毒的流行[2]。2014年，四川、黑龍江發(fā)生的由第2.3.4.6分支H5N6亞型抗原變異株引起的AI疫情表明，流行病毒的抗原性已發(fā)生較大變異。因此，有必要重新構(gòu)建針對第2.3.4.6分支的疫苗候選株，以應(yīng)對該分支病毒的流行和威脅。本研究以篩選出的第2.3.4.6分支的H5N6亞型代表株C6為表面基因供體，以PR8的內(nèi)部基因為骨架，構(gòu)建了疫苗候選株rC6，并進(jìn)行了免疫效力和攻毒保護(hù)試驗，為該分支禽流感病毒的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細(xì)胞、載體以及實驗動物

A/Chicken/SC/6/2014（H5N6）（C6）、A/ Goose/SC/7/2014（H5N6）（G7）及A/Puerto Rico/8/34（PR8）均由本實驗室分離和保存；雙向表達(dá)載體pH205和293T細(xì)胞由本實驗室構(gòu)建保存；SPF雞胚和SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

QIAamp Viral RNA mini Kit購自Qiagen公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase、PrimeScript Reverse Transcriptase、T4 DNA連接酶、pMD19-T、DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BsmBI、BsaI購自NEB公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計

擴(kuò)增PR8內(nèi)部基因全長的引物根據(jù)Hoffmann發(fā)表的文獻(xiàn)合成[3]。擴(kuò)增C6病毒株HA基因突變引物根據(jù)其HA的多個連續(xù)堿性氨基酸位點的特異性序列設(shè)計，從而使具有強毒株分子特征的HA裂解位點-PLRERRRKR-突變成弱毒株的HA裂解位點-PQRETR-（圖1）。HA、NA和HA突變體（HAmut）的引物由生工生物公司合成（表1）。

圖1 HA基因堿性氨基酸裂解位點處的分子修飾

表1擴(kuò)增C6病毒株HA、HAmut、NA基因所用引物

1.4 病毒RNA的提取及基因擴(kuò)增

按照QIAamp Viral RNA mini Kit說明書提取病毒RNA，利用PrimeScript Reverse Transcriptase進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase擴(kuò)增病毒各基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA膠回收試劑盒純化回收，然后與pMD19-T載體連接，陽性重組質(zhì)粒送生工生物測序鑒定。

對于HAmut的構(gòu)建，以鑒定正確的C6 HA陽性重組質(zhì)粒為模板，以兩對引物HA-F/HA-Mut-R和HA-Mut-F/HA-R分別擴(kuò)增出HA1和HA2片段，然后以HA1和HA2的混合物為模板，HA-F/HA-R為引物，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進(jìn)行重疊延伸PCR（SOE-PCR），擴(kuò)增出HAmut片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，與pMD19-T載體連接，陽性重組質(zhì)粒測序鑒定。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將鑒定正確的C6 HAmut、NA重組質(zhì)粒以及6個PR8內(nèi)部基因片段重組質(zhì)粒經(jīng)相應(yīng)的BsmBI或BsaI酶切，與BsmBI酶切的表達(dá)載體pH205相連，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，并利用DNAStar7.0軟件進(jìn)行序列分析。

1.6 病毒拯救與鑒定

按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行。將6個PR8內(nèi)部基因重組表達(dá)質(zhì)粒和2個C6 HAmut和NA表面基因重組表達(dá)質(zhì)粒各0.6μg混合共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后將細(xì)胞懸液接種10日齡SPF雞胚，0.2ml/枚，37℃繼續(xù)孵化，72h后收集尿囊液，測定其血凝活性。取血凝陽性的尿囊液經(jīng)10000倍稀釋后接種10日齡的SPF雞胚擴(kuò)增病毒，0.1ml/枚，72h后收集尿囊液，于-70℃保存?zhèn)溆?。重組病毒命名為rC6。提取救獲病毒的RNA，用RT-PCR擴(kuò)增病毒的全基因組并測序。1.7 免疫保護(hù)試驗和免疫交叉保護(hù)試驗

將40只21日齡的SPF雞分成4組，每組10只，其中一組經(jīng)頸部皮下接種rC6滅活油苗、一組接種Re-5滅活油苗，接種劑量各為0.3ml/只，一組為不接種疫苗直接攻毒組，一組為健康對照組。免疫后21天采血分離血清，分別用雞源H5N6亞型C6株和鵝源H5N6亞型G7株作為抗原測定抗體效價，并用106EID50的C6病毒對各組雞進(jìn)行滴鼻攻毒，連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計排毒、發(fā)病和死亡情況。

免疫交叉保護(hù)試驗方法同上。其中攻毒用的野毒株為鵝源G7株。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)PR8內(nèi)部基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PR8的6個內(nèi)部基因片段PB2、PB1、PA、NP、M、NS經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，與pMD19-T載體連接，測序正確后經(jīng)酶切后分別與酶切處理好的pH205表達(dá)載體連接，構(gòu)建表達(dá)6個內(nèi)部基因的重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR、測序鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建正確（圖2）。

M. 1kb plus DNA Marker；1. PB2；2. PB1；3. PA；4. NP；5. M；6. NS圖2 表達(dá)PR8內(nèi)部基因重組載體的PCR鑒定

2.2 表達(dá)HAmut重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用SOE-PCR擴(kuò)增C6株的HA基因，并將其克隆至pH205載體中，構(gòu)建pH205-HAmut重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建正確（圖3）。測序結(jié)果表明，HA裂解位點的氨基酸序列已由野生型病毒HA分子的-PLRERRRKR-突變?yōu)?PQRETR-，即被修飾為典型的H5亞型低致病性AIV HA分子特征。

M. DL2000 DNA Marker；1. HA；2. HA1；3. HA2；4. HAmut；5. NA圖3 表達(dá)C6病毒株HA、HAmut和NA重組質(zhì)粒的PCR鑒定

2.3 重組病毒的拯救與鑒定

將構(gòu)建成功的8個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用反向遺傳技術(shù)拯救出重組病毒rC6。在雞胚繁殖一代后，提取病毒RNA、反轉(zhuǎn)錄，對拯救病毒的全基因組進(jìn)行擴(kuò)增、測序。測序結(jié)果表明，HA基因裂解位點已被突變?yōu)?PQRETR-，為低致病性AIV分子特征，其余7個片段均未發(fā)生突變，均與預(yù)期的病毒疫苗株一致。

2.4 SPF雞的免疫保護(hù)試驗和交叉免疫保護(hù)試驗

rC6滅活油苗的免疫和交叉免疫保護(hù)試驗見表2。免疫后21天，用雞源H5N6亞型C6株作為抗原，測得rC6重組滅活油苗免疫雞的平均抗體效價為29.4；用鵝源H5N6亞型AIV G7株做抗原，測得rC6重組滅活油苗免疫雞的平均抗體效價為28.9；用Re-5作為抗原，測得rC6重組滅活油苗免疫雞的平均抗體效價為22.9。Re-5滅活油苗免疫后21天，用Re-5作為抗原，測得Re-5重組滅活油苗免疫雞的平均抗體效價為28.9，用C6株作為抗原測得的平均抗體效價為24.5；用G7株作為抗原測得的平均抗體效價為24.7。攻毒保護(hù)試驗結(jié)果顯示，rC6重組滅活疫苗為SPF雞提供的針對同源病毒的免疫保護(hù)率為100%；用鵝源H5N6亞型AIV G7株攻毒，rC6重組滅活疫苗提供的交叉免疫保護(hù)率為100%。Re-5滅活疫苗對C6和G7株病毒提供的免疫保護(hù)率僅為10%。未免疫組經(jīng)攻毒C6和G7后5天內(nèi)全部死亡，健康對照組的雞正常。

表2 rC6重組滅活疫苗對SPF雞的免疫和交叉免疫保護(hù)試驗

3 討論

從cDNA克隆拯救出負(fù)鏈RNA病毒是90年代分子病毒學(xué)研究領(lǐng)域最振奮人心的技術(shù)，也為制備新型的禽流感疫苗開啟了新的思路和方法。近年來，世界各地不斷有禽流感事件發(fā)生，尤其是高致病性禽流感，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重危害著人類的健康。加之禽流感一直處于不斷變異之中，這給禽流感的防控增加了難度。

2005年，我國開始實施針對禽流感的大規(guī)模免疫政策，隨著病毒的不斷變異，疫苗也從Re-1更新到Re-4和Re-5，到目前的Re-6和Re-7。從流行病學(xué)調(diào)查來看，Re-5對應(yīng)的第2.3.4分支的病毒出現(xiàn)了一些變異毒株?？乖砦环治鲲@示，與該分支的疫苗株Re-5相比，C6病毒株在Q131L、S139P、D140N、A143T、S145L、T156M、I167T、Q208K、K234Q、V281M等抗原位點出現(xiàn)了變化[4，5]。Re-5與C6之間的交叉HI相關(guān)系數(shù)R=0.39（R?0.5），說明C6毒株與疫苗株之間的抗原性差異明顯。

本研究采用反向遺傳操作技術(shù)，以A/Puerto Rico/8/34（PR8）的內(nèi)部基因為骨架，A/CK/ SC/6/2014（H5N6）的表面基因為供體，通過對其HA基因進(jìn)行分子修飾，去除HA蛋白裂解位點處的多個連續(xù)堿性氨基酸，使其獲得低致病性AIV的分子特征[6]，同時又保證了重配病毒與流行株的抗原匹配性，成功構(gòu)建了針對第2.3.4.6分支的H5N6亞型AIV疫苗候選株rC6。在用SPF雞進(jìn)行的免疫保護(hù)試驗和交叉免疫保護(hù)試驗中，rC6滅活油苗免疫21天的平均抗體效價為29.4，交叉免疫的平均抗體效價也有28.9，而用Re-5作為抗原測得的抗體效價只有22.9，說明這些新近流行的毒株與原有針對第2.3.4分支的Re-5疫苗在抗原性上已經(jīng)差別很大。免疫攻毒保護(hù)試驗也驗證了這一結(jié)論，rC6重組滅活疫苗可以提供SPF雞針對同源和異源H5N6病毒100%的保護(hù)，而Re-5疫苗只能提供大約10%的保護(hù)。本研究構(gòu)建的rC6重組疫苗候選株為該分支病毒的防控提供了有益的探索和嘗試。

H5亞型高致病性禽流感病毒的變異情況值得關(guān)注，第2.3.4分支的病毒出現(xiàn)了顯著的變異，尤其是第2.3.4.6分支病毒的大量出現(xiàn)，應(yīng)引起足夠的重視。獸醫(yī)主管部門應(yīng)加強對禽流感疫苗的質(zhì)量管控和臨床應(yīng)用效果的監(jiān)測評估，并根據(jù)疫情的變化及時調(diào)整疫苗生產(chǎn)用種毒。并積極調(diào)整防控策略，由單純依賴疫苗的防控方針，轉(zhuǎn)向綜合性的防控策略。

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Construction of Reverse Genetic Vaccine Strain against Variant H5N6 Avian Inf uenza Virus and its Protective Eff cacy Test

Jiang Wenming，Hou Guangyu，Wang Suchun，Li Jinping，Liu Shuo，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

To control of H5N6 subtype highly pathogenic avian inf uenza viruses（HPAIVs） with antigenic changes（clade 2.3.4.6），and the potential pandemic threat to poultry，a reassortant virus，named rC6，was constructed using reverse genetics in the study. The virus contained modif ed HA and NA genes of an epidemic strain A/Chicken/SC/6/2014 with the internal genes derived from A/Puerto Rico/8/34（PR8）. The reassortant virus was attenuated by removal of the multi-basic amino acid motif in the HA gene by mutation and deletion（from PLRERRRKR to PQRETR），thus resulting in a candidate vaccine virus. Immune eff cacy tests showed that the inactivated rC6 recombinant vaccine could induce high levels of hemagglutination inhibition antibody. Challenge tests showed that rC6 recombinant inactivated vaccines provided SPF chickens with 100% protection against homologous and heterologous H5N6 virus，and Re-5 vaccine against clade 2.3.4 viruses only provided about 10% protection. The rC6 recombinant vaccine candidate strains using reverse genetics technology provided a benef cial attempt for prevention and control of the virus of clade 2.3.4.6.

：avian inf uenza virus；variant；H5N6；reverse genetics；vaccine

S852.657

：A

：1005-944X（2015）01-0064-04