李勇慧， 押輝遠(yuǎn)， 程彥偉， 于相麗

(洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)系 河南 洛陽 471022)

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水稻轉(zhuǎn)座子對(duì)低能離子束輻照反應(yīng)研究

李勇慧， 押輝遠(yuǎn)， 程彥偉， 于相麗

(洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)系 河南 洛陽 471022)

用不同注量的低能N+離子束輻照水稻種子并培養(yǎng)發(fā)芽，根據(jù)培養(yǎng)7 d時(shí)發(fā)芽率、苗高和根長的結(jié)果，將輻照后的材料分為非生長抑制組(NGI)和生長抑制組(GI).為探討水稻應(yīng)答N+離子束輻照過程中轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，用RNA-seq技術(shù)對(duì)對(duì)照組、NGI組和GI組培養(yǎng)3 d的水稻芽體總RNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)水稻基因組比對(duì)、表達(dá)量的分析及基因功能注釋的結(jié)果顯示：共檢測(cè)到水稻轉(zhuǎn)錄本36 382種，其中3組樣品中檢測(cè)到1 655種TEs有表達(dá)，對(duì)照、NGI、GI組樣品中表達(dá)的TEs種類分別為972,818,1 271.由此可知生長抑制的樣品中表達(dá)的轉(zhuǎn)座因子最多(比對(duì)照多299種)，說明一定劑量的低能離子束輻照能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)轉(zhuǎn)座潛能，增加染色體結(jié)構(gòu)改變的可能性，這可能是低能離子束誘變植物的機(jī)制之一.

水稻； 離子束輻照； RNA-seq； 轉(zhuǎn)座子； 差異表達(dá)的基因

0 引言

低能離子束是有效的輻射誘變?cè)?，?jīng)過20多年的發(fā)展，用不同的植物和微生物作為研究材料，進(jìn)行多種離子注入的生物效應(yīng)和作用機(jī)理的研究已取得了很大進(jìn)展，創(chuàng)造了較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益.低能離子束對(duì)生物體的誘變作用具有損傷小、突變率高、突變譜廣等特點(diǎn)[1].然而低能離子束穿透能力非常弱，按照LSS理論計(jì)算，60 keV14N1+在蛋白質(zhì)內(nèi)的射程和100 keV14N1+在小麥內(nèi)的射程稍大于0.2 μm，110 keV56Fe1+在麥胚內(nèi)的射程還不足0.2 μm[2].衛(wèi)增泉通過實(shí)驗(yàn)獲得了110 keV56Fe1+離子注入小麥種子胚內(nèi)的最大射程約為5 μm[3].由此可知低能離子束輻照射程這么淺，不可能到達(dá)胚細(xì)胞核內(nèi)損傷生長點(diǎn)的遺傳物質(zhì).但研究表明離子注入生物體時(shí)同時(shí)存在能量沉積、動(dòng)量傳遞及電荷交換效應(yīng)，能夠引起染色體的畸變，導(dǎo)致DNA鏈堿基的損傷和斷裂，從而使遺傳物質(zhì)在基因水平或分子水平上發(fā)生改變或缺失，提高變異的頻率[4].根據(jù)理論和實(shí)踐的矛盾，本文認(rèn)為低能離子注入水稻、小麥等作物種子誘發(fā)突變的機(jī)理不僅是注入離子的直接作用，更主要的是一系列次級(jí)過程的復(fù)合作用.研究發(fā)現(xiàn)低能離子束輻照誘變效應(yīng)的原因可能與低能離子束輻照引起細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)[5]，而轉(zhuǎn)座子(transposable elements，TEs)的活性?？梢鹑旧w結(jié)構(gòu)的改變，因此本研究推測(cè)低能離子束輻照能夠激活一定數(shù)量轉(zhuǎn)座因子,并引起染色體結(jié)構(gòu)改變.

有研究表明低能離子束輻照水稻后的確能促進(jìn)某些反轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性[6].但至今為止,還沒有從轉(zhuǎn)錄組水平上研究低能離子束輻照對(duì)植物轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響的報(bào)道，而轉(zhuǎn)錄組水平的研究對(duì)闡明低能離子束輻照誘變機(jī)制十分重要.高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為全面快速了解轉(zhuǎn)錄組特性提供了一個(gè)機(jī)會(huì)[7].RNA-seq可以從幾方面分析基因組的轉(zhuǎn)錄，提供測(cè)序數(shù)據(jù)的同時(shí)也能檢測(cè)選擇性剪接事件和量化基因表達(dá)水平[8].在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時(shí)，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具[9].基于RNA-seq技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究將為闡明離子束輻照植物生物效應(yīng)分子機(jī)制提供全新的生物學(xué)研究視角，而國內(nèi)外通過RNA-seq的轉(zhuǎn)錄組學(xué)來揭示離子束輻照植物生物效應(yīng)的分子機(jī)制的研究相對(duì)缺乏.所以本研究通過對(duì)低能離子束輻照水稻后全基因組的轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步探討低能離子束輻照誘導(dǎo)突變體的機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 植物材料

栽培品種新稻-18成熟后 (OryzasotivaL.subsp.joponica Kato)，采收稻穗，手工去穎殼，避免損傷稻胚，選取大小一致的完整種子作為實(shí)驗(yàn)材料.

1.2 低能離子束輻照

低能離子束輻照時(shí)，將水稻(含水量6.7%)胚朝上豎直固定在軟塞上，軟塞置于培養(yǎng)皿(10 cm×10 cm)中.種子在真空(10-2MPa)的靶室中(注入機(jī)型號(hào)：UIL.0.512, TNV, 俄羅斯)進(jìn)行輻照注入，電流強(qiáng)度為2 mA，離子能量為40 keV，離子注量分別為：0，1，2，4，6，8×1017N+/cm2，另設(shè)空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組.每組樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù).每次重復(fù)用水稻種子150粒.

1.3 生物材料培養(yǎng)和發(fā)芽率、苗高、根長的測(cè)定

將無菌濾紙用無菌水潤濕后放在無菌的培養(yǎng)皿底，實(shí)驗(yàn)材料放在無菌濾紙上，置于恒溫箱(28 ℃)中培養(yǎng)(12 h光/12 h暗)，每12 h向培養(yǎng)皿中的濾紙上均勻滴加無菌水10 mL，保持濾紙濕潤.培養(yǎng)96 h后，從每個(gè)離子注量處理的3個(gè)重復(fù)中共隨機(jī)取出100個(gè)芽代表該處理的測(cè)序樣品，作為提取混株總RNA的材料，剩下的芽培養(yǎng)至7 d(168 h)后手工測(cè)定發(fā)芽率(發(fā)芽數(shù)/種植的總種子數(shù))、苗高(胚軸處到最長葉子的頂端)、根長(測(cè)定最長根的根長：胚軸到最長根根尖的長度).

1.4 測(cè)序樣品的準(zhǔn)備

選取的材料是培養(yǎng)96 h的水稻芽體，用它來提取RNA并用來RNA-seq.從每組處理試驗(yàn)材料中，挑選上述生長96 h，株高大約一致的50個(gè)全芽提取混株總RNA池(Trizol)，實(shí)驗(yàn)中將得到空白對(duì)照的一個(gè)RNA池(對(duì)照：作為一個(gè)測(cè)序樣品)，以及離子注量為1,2,4,6,8×1017N+/cm2處理下的5個(gè)RNA池.然后根據(jù)測(cè)得的生物學(xué)效應(yīng)將1,2×1017N+/cm2注量下的RNA池各取10 μg混成一個(gè)測(cè)序樣品(NGI：和對(duì)照相比沒有顯著差異的生長抑制效應(yīng))，6,8×1017N+/cm2處理下的RNA池各取10 μg混成一個(gè)測(cè)序樣品(GI：和對(duì)照相比具有極顯著差異的生長抑制效應(yīng)).

1.5 RNA測(cè)序、cDNA文庫的準(zhǔn)備、測(cè)序

樣品測(cè)序在Illumina HiSeq2000測(cè)序儀進(jìn)行雙末端測(cè)序.用Illumina數(shù)據(jù)處理軟件(1.8版本)對(duì)熒光圖象進(jìn)行測(cè)序、堿基的處理和質(zhì)量評(píng)價(jià)的運(yùn)算.測(cè)序數(shù)據(jù)提交到GEO基因庫，收錄號(hào)是GSE45908 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/query/ acc. cgi? acc=GSE45908).

1.6 序列比對(duì)與差異表達(dá)基因計(jì)算

測(cè)得的序列用Tophat v2.0.5比對(duì)到水稻基因組序列上(MSU v7.0)，差異基因用RPKM(reads per kilobase per million)方法計(jì)算.FDR≤ 0.05和2 (FC) ≥ 1的轉(zhuǎn)錄物視為差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄物.

2 結(jié)果

2.1 發(fā)芽率、苗高和根長的結(jié)果分析

結(jié)果顯示從發(fā)芽率(圖1A)上看，雖然各個(gè)處理組的發(fā)芽率都高于對(duì)照，但處理與對(duì)照之間沒有顯著的統(tǒng)計(jì)差異性.通過苗高比較(圖1B)，發(fā)現(xiàn)4，6，8×1017N+/cm2處理與對(duì)照相比呈極顯著差異，而1，2×1017N+/cm2處理與對(duì)照相比沒有明顯差異，筆者認(rèn)為4，6，8×1017N+/cm2的離子束輻照抑制苗高.根據(jù)根長的比較(圖1C)，得到6，8×1017N+/cm2處理與對(duì)照相比呈極顯著差異，其他處理與對(duì)照相比沒有顯著差異.在這兩個(gè)注量下，水稻的根的生長受到抑制.

綜合發(fā)芽率、苗高、根長的統(tǒng)計(jì)比較，本文認(rèn)為，在較小的離子注量1，2×1017N+/cm2下產(chǎn)生不顯著的損傷效應(yīng)，在較大的離子注量6，8×1017N+/cm2下產(chǎn)生顯著的損傷效應(yīng).因此，把1，2×1017N+/cm2注量的材料混合成一個(gè)RNA池作為一個(gè)測(cè)序樣品(NGI)，把6，8×1017N+/cm2注量的材料混合成一個(gè)RNA池作為一個(gè)測(cè)序樣品(GI)進(jìn)行高通量測(cè)序，然后和對(duì)照樣品進(jìn)行比較.

圖1 不同輻照處理后種子的發(fā)芽率(A)，苗高(B)和根長(C)

2.2 差異表達(dá)的基因(DEGs)識(shí)別

根據(jù)測(cè)得的reads在水稻基因組上的mapping以及功能注釋(http://rice.plantbiology.msu.edu)，從對(duì)照組中找出已注釋的水稻轉(zhuǎn)錄本36 382個(gè)，其中NGI與對(duì)照比較，544個(gè)轉(zhuǎn)錄本存在差異表達(dá)，占總轉(zhuǎn)錄本的1.49%；GI與對(duì)照比較，776個(gè)轉(zhuǎn)錄本存在差異表達(dá)，占總轉(zhuǎn)錄本的2.14%.

通過比較，發(fā)現(xiàn)有44個(gè)轉(zhuǎn)錄本在對(duì)照和NGI中都沒有表達(dá)，只在GI中表達(dá)，也就是說，這些基因只在GI(高劑量，損傷效應(yīng))中被誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因可能與損傷效應(yīng)的形成有關(guān)，在抵御輻射損傷過程中起作用.在只有GI中誘導(dǎo)的基因有些是全新的剪接體.

2.3 差異表達(dá)轉(zhuǎn)座子的檢測(cè)

根據(jù)測(cè)得的reads在水稻基因組上的mapping以及功能注釋(http://rice.plantbiology.msu.edu)，注釋數(shù)據(jù)庫顯示水稻基因組上共有可移動(dòng)因子11 851種，本研究測(cè)到有表達(dá)的轉(zhuǎn)座子1 655種，對(duì)照中表達(dá)的轉(zhuǎn)座因子占檢測(cè)到的表達(dá)轉(zhuǎn)座子的58.7%(972/1 655)；NGI占總表達(dá)轉(zhuǎn)座子的49.4%(818/1 655)；GI(損傷的樣品)占總表達(dá)轉(zhuǎn)座子的76.8%(1 217/1 655).其中差異表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)座子共有55個(gè)，NGI和對(duì)照比較差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)座子有14個(gè)，占總差異表達(dá)轉(zhuǎn)座子的25.5%；GI和對(duì)照比較差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)座子有24個(gè)，占總差異表達(dá)轉(zhuǎn)座子的43.6%，相對(duì)于對(duì)照，GI和NGI共同差異表達(dá)的轉(zhuǎn)座子有7個(gè).

由表1可知，在NGI差異表達(dá)的14個(gè)轉(zhuǎn)座子中，有6個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)，6個(gè)完全抑止，2個(gè)上調(diào).由表2可知，在GI差異表達(dá)的24個(gè)轉(zhuǎn)座子中，有5個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)，2個(gè)完全抑止，2個(gè)下調(diào)，15個(gè)上調(diào)表達(dá).由表3知，在GI和NGI共同差異表達(dá)7個(gè)轉(zhuǎn)座子中，有5個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)，2個(gè)上調(diào)表達(dá).

表1 NGI差異表達(dá)的轉(zhuǎn)座子Tab.1 The differentially expressed TEs of NGI

表2 GI差異表達(dá)的轉(zhuǎn)座子Tab.2 The differentially expressed TEs of GI

表3 GI and NGI共同差異表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)座子Tab.3 The differentially expressed TEs of GI vs. control and NGI vs. control

3 討論

綜合發(fā)芽率、苗高、根長的統(tǒng)計(jì)比較，本文認(rèn)為，和對(duì)照相比，在NGI中,即較小的離子注量(1，2×1017N+/cm2)下產(chǎn)生不顯著的損傷效應(yīng)，在GI中，即較大的離子注量(6，8×1017N+/cm2)下產(chǎn)生顯著的損傷效應(yīng)，即離子束輻照在較大的離子注量下，顯著抑止苗高和根長的生長，但和其他輻照相比，這種較大劑量離子束輻照對(duì)水稻種子的損傷效應(yīng)是比較低的，屬于低損傷效應(yīng)[10-11].

已知對(duì)照中總轉(zhuǎn)錄本36 382個(gè)，其中NGI與對(duì)照相比，差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本占總轉(zhuǎn)錄本的1.49%；GI與對(duì)照比較，差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本占總轉(zhuǎn)錄本的2.14%.GI相對(duì)NGI比對(duì)照差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本高0.65%，說明較高劑量比較低劑量的離子束輻照差異表達(dá)的基因數(shù)多，且通過比較發(fā)現(xiàn)有44個(gè)轉(zhuǎn)錄本在對(duì)照和NGI中都沒有表達(dá)，只在GI中表達(dá)，說明這些基因可能在抵御輻射損傷過程中起作用.本研究中NGI和GI分別與對(duì)照相比有14和24個(gè)差異表達(dá)的基因作為轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子被注釋.且有7個(gè)與轉(zhuǎn)座子相關(guān)的差異表達(dá)基因在NGI、GI和對(duì)照3者中均表達(dá).通過比較，發(fā)現(xiàn)GI和NGI與對(duì)照相比，GI較NGI差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本多，有表達(dá)的轉(zhuǎn)座子多(多453個(gè))，差異表達(dá)的轉(zhuǎn)座子多(多12.7%).這說明低能離子束輻照激活了水稻中一些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性.

轉(zhuǎn)座因子又稱轉(zhuǎn)座子(TEs)，是指DNA片段可以在一個(gè)細(xì)胞的基因組中移動(dòng)到不同的位置，能引起基因組DNA的突變或數(shù)量的增加或減少.TEs是大多數(shù)真核生物基因組的重要組成部分，在水稻基因組中含量占35%.TEs在基因組和基因的進(jìn)化中起著重要作用.TEs能改變一些基因的表達(dá)，因此，可以借助一些機(jī)制例如RNA干涉來實(shí)現(xiàn)TEs對(duì)臨近基因的表觀遺傳調(diào)控.且轉(zhuǎn)座因子對(duì)臨近基因的表達(dá)有高的潛在影響[6,12].因此轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄在植物中被嚴(yán)格限制，只有在特定的情況下如病原體感染、化學(xué)誘變劑、物理損傷或者不同的非生物脅迫才能被激活[13,14-16].Maekawa研究表明離子束輻照激活了一個(gè)沉默的控制水稻葉顏色TE，從而使不穩(wěn)定的雜色葉子的水稻種子被離子束輻照后，在M2代得到穩(wěn)定的黃色葉子的水稻[17].研究也發(fā)現(xiàn)低能離子束輻照激活了玉米沉默的 minimal Mutator TE[15].

本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)?shù)湍茈x子束輻照劑量增大時(shí)，GI較NGI中表達(dá)的轉(zhuǎn)座子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本多，可能增加轉(zhuǎn)座子調(diào)控鄰近基因表達(dá)的機(jī)會(huì)，并對(duì)當(dāng)代表型產(chǎn)生影響；同時(shí)增加了轉(zhuǎn)座的潛能，使基因重組，引起更多可遺傳的突變，這可能是低能離子束輻照植物具有“低損傷、高突變、突變譜廣”的重要原因，為優(yōu)質(zhì)新品種的選育提供了良好的誘變工具[18].總之，本研究表明：低能離子束輻照誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本增多，有表達(dá)的和差異表達(dá)的轉(zhuǎn)座子增多，激活了轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座，引起DNA片段的缺失、增加、重復(fù)，造成染色體結(jié)構(gòu)改變，這些可能是產(chǎn)生低能離子束注入生物效應(yīng)機(jī)理的重要原因之一.

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The Research of Transposable Element in Rice Reaction to Low-energy Ion Beam Bombardment

LI Yong-hui, YA Hui-yuan, CHENG Yan-wei, YU Xiang-li

(LifeScienceCollege,LuoyangNormalUniversity,Luoyang471022,China)

The rice seeds irradiated by low-energy N+ion beam were cultured to germinate, then for seven days. They were divided into the non-inhibition growth group (NGI: 1, 2×1017N+/cm2) and inhibition growth group (GI: 6,8×1017N+/cm2) according to the germination percentage, height of seedling and root long determination. For the purpose of exploring the functional gene expression of transposable elements (TEs) in rice responding to N+beam implantation, RNA-seq was used to analyze the total RNA from 3-day rice seedlings in the control, GI and NGI group. The results showed that total 36 382 transcriptions were obtained in the sequencing data, which included 11 851 known rice transposon. It was 972, 818 and 1 271 genes of TEs expressed in control, NGI and GI group respectively as 1 655 types of TEs expression in total were detected in the samples. These findings indicated that a certain dose of low-energy ion beam irradiation could promote transcription of transposons, enhance transpositional potential and increase chromosomal structural changes. This may be one mechanism of plant mutants induced by low energy ion beam.

rice; lon beam irradiation; RNA-seq; transposalbe elements; DEGs

2014-05-21

河南省高校青年骨干教師資助項(xiàng)目，編號(hào)2011ggjs-154；NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項(xiàng)目，編號(hào)U1204307.

李勇慧(1977-)，女，河南洛陽人，副教授，碩士，主要從事植物學(xué)生物技術(shù)研究，E-mail:huiyongli8209@126.com; 通訊作者：押輝遠(yuǎn)(1977-)，男，河南禹州人，副教授，博士，主要從事離子束輻射效應(yīng)機(jī)制研究，E-mail:yahuiyuan@yahoo.com.cn.

Q691

A

1671-6841(2015)01-0107-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.01.023