付艾妮，朱書秀，艾永循，付薔

(江漢大學醫(yī)學院中醫(yī)系，武漢 430056)

核桃仁提取物對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶能力和海馬區(qū)神經(jīng)元的保護作用*

付艾妮，朱書秀，艾永循，付薔

(江漢大學醫(yī)學院中醫(yī)系，武漢 430056)

目的 比較3種核桃仁提取物對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠學習記憶能力及海馬區(qū)超微病理的影響。方法 采用Meynert基底核注射Aβ1-40建立AD模型，造模成功后隨機分為核桃仁-水組、核桃仁-乙醇組和核桃仁-丙酮組，模型對照組，每組10只。另外選取正常對照組10只和假手術組10只。模型對照組不進行灌胃治療；核桃仁-丙酮組、核桃仁-乙醇組和核桃仁-水組于造模成功后分別灌胃給予核桃仁丙酮提取物、乙醇提取物、水提取物(相當于生藥0.3 g·mL-1)，灌胃劑量為3 g·kg-1。以Morris水迷宮評價大鼠學習記憶能力，用透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結構。結果 核桃仁-丙酮組、核桃仁-乙醇組、核桃仁-水組在前3 d尋找平臺的時間下降較迅速，第3天分別為(51.80±4.37)，(61.20±4.67)，(59.63±5.24)s，模型對照組為(67.67±6.12)s，從第3天開始趨于平穩(wěn)，與模型對照組比較，仍差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以核桃仁-丙酮組效果最佳(P<0.01)，海馬區(qū)神經(jīng)元超微結構基本正常。結論 核桃仁丙酮提取物具有較好防治AD的作用。

核桃仁；阿爾茨海默??；學習記憶能力；超微結構

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以進行性記憶和認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，為人類繼心腦血管疾病和腫瘤之后的第三大死因[1]。其發(fā)病機制目前有遺傳學、β淀粉樣蛋白學、膽堿能損傷學等多種學說，典型的病理學特征為老年斑、神經(jīng)原纖維纏結、神經(jīng)元減少及顆?？张葑冃缘萚2]。臨床治療大多采用改善膽堿能神經(jīng)元功能的藥物、激素類藥物、非甾體抗炎藥等，但這些藥物僅能改善部分臨床癥狀，并不能有效阻斷病情發(fā)展。祖國醫(yī)學認為該病“病位在腦，腎精虧虛為本”。核桃具有補腎、溫肺、潤腸、強身健腦之功，被歷代醫(yī)家和養(yǎng)生學家視為益壽精品[3-4]。目前對核桃仁大多從抗氧化、抗衰老、改善小鼠學習記憶能力進行研究[5]，但哪種成分起作用尚不清楚。水、丙酮、乙醇為常用中藥有效成分提取劑，由于性質(zhì)不同，提取的有效成分不同。本課題組[6]前期研究發(fā)現(xiàn)：核桃仁提取物可改善AD小鼠腦內(nèi)免疫炎性反應，提高抗氧化能力，由此推測，核桃仁可能通過此途徑影響神經(jīng)元的超微結構，減少神經(jīng)元細胞變性和壞死。筆者在本研究對核桃仁分別采用水、乙醇、丙酮進行提取，并將3種提取物灌胃治療AD模型大鼠，觀察其對AD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元超微病理的影響以及學習記憶能力的保護作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 3個月齡健康清潔級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2004-0007。室溫(22±2) ℃，相對濕度(55～65)%，光照適度，通風潔凈良好。

1.2 材料 核桃為陜西產(chǎn)，由江漢大學付薔講師鑒定并提取。核桃仁水提取物、核桃仁乙醇提取物、核桃仁丙酮提取物(取核桃仁，曬干，粉碎，加水浸泡24 h，分別使用水、乙醇和丙酮提取至核桃仁生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。Aβ1-40(美國Biosource公司，批號：25315-01s，Aβ孵育：Aβ1-40加入0.1%三氟乙酸后放入38 ℃水浴恒溫箱孵育48 h，使其成為凝聚狀態(tài)備用。

1.3 儀器 AD造模器材：WDT-Ⅱ微電極推進器腦立體定位儀(國營西北光化學儀器廠)，臺式牙鉆機(成都康發(fā)醫(yī)療器械有限公司)，微量注射器(上海醫(yī)用儀器廠，規(guī)格：5 μL)；Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院生產(chǎn))，F(xiàn)EI Tecnai G212透射電鏡(美國)。

1.4 AD動物模型的制作 參照文獻[7-8]進行，采用腹腔注射10%水合氯醛(380 mg·kg-1)進行麻醉，固定于腦立體定向儀，以前囟為原點，旁開3.0 mm，向后1.4 mm為穿刺點，采用微量注射器自腦表面進針7.0 mm，針尖至Meynert基底核，將孵育好的Aβ1-40在2 min內(nèi)緩慢注入，每次注射1 μL(5 μg)，留針10 min，使Aβ1-40充分浸潤局部組織，注射完畢后，在7 min內(nèi)緩慢抽出微量注射器，縫合表皮。假手術組注射等量0.9%氯化鈉注射液。所有操作均在無菌條件下進行，術后每只大鼠腹腔注射青霉素1萬U，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。造模完成后第31天，對大鼠進行Y字型水迷宮篩選，凡15次測試中正確次數(shù)較造模前下降1/3者為造模成功[9]。

1.5 動物分組與給藥 正常對照組10只，不進行任何處理及治療，假手術組10只，不進行灌胃治療。將造模成功動物隨機分為模型對照組、核桃仁-丙酮組、核桃仁-乙醇組、核桃仁-水組，每組10只。模型對照組不進行灌胃治療；核桃仁-丙酮組、核桃仁-乙醇組和核桃仁-水組于造模成功后分別灌胃給予核桃仁丙酮提取物、乙醇提取物、水提取物(相當于生藥0.3 g·mL-1)，灌胃劑量為3 g·kg-1。每日1次，每6 d為一個療程，每療程結束后休息1 d，連續(xù)治療4個療程。

1.6 行為學測試

1.6.1 定位航行實驗 采用Morris水迷宮進行定位航行訓練，水溫控制約為25 ℃，每日上、下午各4次，將大鼠面向池壁分別從4個象限放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)尋找到平臺的時間(潛伏期)。如果在2 min內(nèi)未找到平臺，則牽引至平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中，其潛伏期計為120 s。實驗歷時5 d。

1.6.2 空間探索實驗 第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入，記錄其2 min 內(nèi)，跨越原平臺象限的次數(shù)與整個象限次數(shù)之比(簡稱原平臺象限跨越次數(shù)比)；在原平臺象限內(nèi)的游泳時間與總時間之比(簡稱原平臺象限游泳時間比)。

1.7 電鏡觀察 在行為學測試完成后第2天，將大鼠處死，并立即置于冰臺，分離海馬組織，置于2%戊二醛1～3 h，1%磷酸鹽緩沖液漂洗3 h，1%鋨酸固定1～2 h，環(huán)氧樹脂包埋，聚合2 d后制作超薄切片，片厚0.5～2.0 μm，透射電鏡下觀察并攝像。

2 結果

2.1 定位航行實驗結果 見表1。模型對照組和藥物組經(jīng)過5 d學習訓練后，尋找平臺時間較以前均有明顯縮短，而且隨著訓練次數(shù)的增加，尋找平臺的時間越來越短，說明各組大鼠經(jīng)過學習訓練后均逐漸學會了尋找平臺。但實驗中發(fā)現(xiàn)：正常對照組和假手術組大鼠經(jīng)過3 d學習，就學會尋找平臺。而模型對照組潛伏期雖有下降趨勢，但仍需約60 s才能找到平臺，較假手術組和正常對照組潛伏期時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。核桃仁-丙酮組、核桃仁-乙醇組、核桃仁-水組在前3天尋找平臺的時間下降較迅速，從第3天開始趨于平穩(wěn)，但與模型對照組比較，仍差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且以核桃仁-丙酮組效果最佳(P<0.01)，但學習記憶能力仍差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 空間探索實驗結果 6組大鼠在撤除平臺后2 min的空間探索實驗結果見表2。大鼠對原平臺象限的記憶越好，在進行空間探索實驗時，跨越原平臺象限次數(shù)越多，在原平臺象限游泳的時間也會越長，時間比和次數(shù)比越大。與正常對照組、假手術組比較，模型對照組時間比和次數(shù)比均顯著減小(P<0.01)，表明大鼠對原平臺的記憶力較差；核桃仁-丙酮組、核桃仁-乙醇組、核桃仁-水組大鼠時間比和次數(shù)比較模型對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明經(jīng)核桃仁提取物治療后，大鼠記憶力有所增強。

表1 6組大鼠定位航行實驗結果

t=2.43～10.64，與正常對照組和假手術組比較，*1P<0.01，*4P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

t=2.43-10.64，Compared with normal control group and sham-operation group，*1P<0.01，*4P<0.05； compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.3 電鏡觀察 模型對照組海馬區(qū)可見一些神經(jīng)細胞變性，胞體縮小，胞膜皺縮，核膜間隙增寬，細胞質(zhì)和細胞器密度增高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹變大、空泡樣變；正常對照組和假手術組神經(jīng)細胞則未出現(xiàn)上述改變，神經(jīng)細胞胞膜完整，結構清楚，細胞質(zhì)基質(zhì)電子密度均勻，未見明顯病變。核桃仁-水組、核桃仁-乙醇組、核桃仁-丙酮組神經(jīng)元細胞核基本正常，核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器基本正常，但核桃仁-水組可見線粒體空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核桃仁-丙酮組可見少量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，核桃仁-乙醇組少數(shù)神經(jīng)細胞可見線粒體輕度腫脹。見圖1。

3 討論

本研究結果表明：AD大鼠海馬區(qū)可見一些神經(jīng)細胞變性，學習能力和記憶能力均下降，而正常對照組和假手術組神經(jīng)細胞未見相應改變，學習記憶能力均優(yōu)于AD大鼠，經(jīng)過核桃仁水提取物、乙醇提取物和丙酮提取物灌胃治療后神經(jīng)元細胞核基本正常，且學習記憶能力較模型對照組提高，差異有統(tǒng)計學意義。說明AD大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細胞出現(xiàn)變性壞死，核桃仁在一定程度上可以保護腦內(nèi)神經(jīng)元細胞。腦組織是氧化損傷最易感的器官，研究表明氧化應激是AD的致病原因之一，氧化損傷直接參與AD等多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程[10]。核桃中含有高濃度的抗氧化劑，可延緩衰老、增強學習記憶能力[11-13]。姜秀梅等[14]發(fā)現(xiàn)：山核桃楸幼果乙醇浸出液可增強血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活力，降低丙二醛的含量，表明其具有明顯的抗氧化作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)核桃仁提取物可以有效降低AD模型大鼠腦內(nèi)炎因子IL-1、IL-6的含量[6]。因此，核桃仁提取物可能通過調(diào)控腦內(nèi)免疫炎性反應和氧化應激反應來保護神經(jīng)元細胞。

表2 6組大鼠空間探索實驗結果

t=2.44～5.94，與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

t=2.44-5.94，Compared with normal control group，*1P<0.01； Compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

A.normal control group；B.sham-operation group；C.model control group；D.Walnutkernel-water group； E.Walnutkernel-ethanol group； F.Walnutkernel-acetone group

Fig.1 Ultrastructure of Hippocampal neuron in six groups of rats

核桃仁水提物的主要成分是皂苷等極性水溶性物質(zhì)；乙醇提取物主要是黃酮類生物堿；而核桃仁丙酮提取物主要含有不飽和脂質(zhì)和維生素[15]。本研究表明，核桃仁丙酮提取物對AD模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元細胞的保護作用最理想，海馬區(qū)僅見少量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞膜富含不飽和脂肪酸，丙酮提取物效果最理想可能與其含有不飽和脂質(zhì)有關，有用于AD治療的潛在價值，但其具體成分有待進一步分析鑒定。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.005

Protection of the Extracts ofWalnutkernelon Learning and Memory Abilities and Hippocampal Neuron in Rat Model of Alzheimer's Disease

FU Aini，ZHU Shuxiu，AI Yongxun，F(xiàn)U Qiang

(DepartmentofTraditionlChineseMedicine，CollegeofMedicineScienceofJianghanUniversity，Wuhan430056，China)

Objective To compare the influence of three kinds ofWalnutkernelextracts on learning and memory ability as well as ultrastructural pathology in hippocampus of Alzheimer's disease (AD) rats. Methods AD rat model was established by injection of amyloid-beta protein (Aβ1-40) into the nucleus basalis of meynert.The AD rats were randomly divided intoWalnutkernel-water group，Walnutkernel-ethanol group，Walnutkernel-acetone group，and the model control group，10 rats in each group.In addition，10 rats of normal control group and 10 rats of sham operation group were selected.The model control group was not treated； the treatment groups were intragastrically givenWalnutkernelwater extract，ethanol extract，and acetone extract (the equivalent of pharmacognosy 0.3 g·mL-1)，respectively，dose 3 g·kg-1.The learning and memory ability was studied by Morris water maze，and ultrastructure of neurons was observed under the transmission electron microscopy. Results The time of looking for platform inWalnutkernel-water group，Walnutkernel-ethanol group，andWalnutkernel-acetone group were dropped swiftly at the beginning of 3 days， the third day is (51.80±4.37)，(61.20±4.67)，and (59.63±5.24)，respectively； the model control group is (67.67±6.12) s.Compared with the model control group，the differences were significance (P<0.05)； However，the acetone extract ofWalnutkernelcan obviously enhance the learning and memory ability (P<0.01)，and the ultrastructure almost returned to normal. Conclusion The acetone extracts ofWalnutkernelhave the function of preventing Alzheimer's disease.

Walnutkernel； Alzheimer's disease； Learning and memory ability； Ultrastructure

2014-08-12

2014-09-20

*武漢市科技攻關項目(200851799524-09)

付艾妮(1962-)，女，湖北武漢人，副教授，學士，研究方向：中醫(yī)養(yǎng)生及中醫(yī)老年病的防治。電話：027-84688067，E-mail：whjdfan@163.com。

朱書秀(1973-)，男，湖北監(jiān)利人，副教授，博士，研究方向：阿茨海默病的針灸防治研究。電話：027-84230392，E-mail：513641769@qq.com。

R285；R742

A

1004-0781(2015)06-0722-04