喬進(jìn)，竇志華，施忠，吳鋒，孟國(guó)梁，陳惠，鄭惠華

(1.江蘇省南通市第三人民醫(yī)院藥劑科，南通 226001；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，南通 226001；3.江蘇安惠生物科技有限公司，南通 226006)

靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿病模型大鼠氧化應(yīng)激的影響*

喬進(jìn)1，竇志華1，施忠1，吳鋒2，孟國(guó)梁2，陳惠3，鄭惠華3

(1.江蘇省南通市第三人民醫(yī)院藥劑科，南通 226001；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，南通 226001；3.江蘇安惠生物科技有限公司，南通 226006)

目的 研究靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響。方法 采用斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠高脂飲食4周后，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素30 mg·kg-1造模。成模后將大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、靈芝多糖組(給予靈芝多糖600 mg·kg-1)、二甲雙胍組(給予二甲雙胍600 mg·kg-1)及聯(lián)合用藥組(給予靈芝多糖300 mg·kg-1+二甲雙胍300 mg·kg-1)，另設(shè)正常對(duì)照組。給藥治療12周末測(cè)量大鼠空腹血糖；測(cè)定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平。結(jié)果 用藥組空腹血糖水平均低于模型對(duì)照組(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組血糖顯著低于單獨(dú)用藥組(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，用藥組血清TC、TG水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)，與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清TC、TG水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.01)；與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，用藥組血清MDA水平明顯降低(P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清MDA較單獨(dú)用藥組明顯降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，用藥組血清CAT、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清CAT、GSH-Px水平較單獨(dú)用藥組明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 靈芝多糖、二甲雙胍聯(lián)合用藥能夠有效對(duì)抗2型糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激作用，效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，其機(jī)制可能與增強(qiáng)體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px水平及調(diào)節(jié)血脂障礙有關(guān)。

靈芝多糖；二甲雙胍；糖尿病；氧化應(yīng)激

糖尿病(DM)是由于胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足而引起的全身糖、脂、蛋白質(zhì)代謝紊亂性疾病，以血糖增高為特點(diǎn)，可導(dǎo)致多臟器、多系統(tǒng)損傷。近年來(lái)，其發(fā)病率逐年上升，已成為繼心血管和腫瘤之后威脅人類生命健康的第三大疾病。因此研究和開(kāi)發(fā)防治糖尿病的藥物日益受到人們的關(guān)注。越來(lái)越多的研究表明，實(shí)驗(yàn)性糖尿病的發(fā)病與氧自由基反應(yīng)增加和抗氧自由基酶類活性降低密切相關(guān)。Brownlee提出的糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說(shuō)更是引起了廣泛關(guān)注，其核心是高糖引起線粒體中超氧陰離子生成過(guò)多，導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致糖尿病的各種并發(fā)癥[1]。目前西藥控制血糖效果良好，但劑量過(guò)大易繼發(fā)耐藥和毒副作用等不良后果。靈芝多糖(ganoderma lucidum polyccharide，GLPs)是靈芝中最有效的成分之一，吳鋒等[2]研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能抑制大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激。二甲雙胍為臨床常用降糖藥之一，具有明顯降糖和改善胰島素抵抗的作用，近年來(lái)研究證實(shí)其具有對(duì)抗氧化應(yīng)激及防治糖尿病血管并發(fā)癥的作用[3]。它們聯(lián)合應(yīng)用治療糖尿病具有理論上的優(yōu)點(diǎn)，在降血糖、抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的同時(shí)可以減少二甲雙胍的用量，避免西藥的毒副作用及耐藥。聯(lián)合應(yīng)用這兩種藥其療效是否優(yōu)于單用，筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者在本實(shí)驗(yàn)觀察靈芝多糖和二甲雙胍聯(lián)用對(duì)2型糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，初步探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量150～180 g，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0001；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2012-0031。大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑 靈芝多糖(江蘇安惠生物科技有限公司，純度74.03%，批號(hào)：100601)；二甲雙胍片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：67100507，規(guī)格：每片0.25 g)。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，批號(hào)：110103)，臨用前用0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液配成濃度為1% STZ溶液。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒，批號(hào)：20110312；丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒，批號(hào)：20110313，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，批號(hào)：20110411，過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒，批號(hào)：20110411，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 One Touch血糖儀(強(qiáng)生公司)；7170A全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)。

1.4 造模與分組 SD大鼠80只，分成正常對(duì)照組和造模組。正常對(duì)照組10只，給予普通飼料喂養(yǎng)。造模組70只給予高脂飲食(脂肪20%、奶粉5%、蛋黃粉5%、基礎(chǔ)飼料70%)，喂養(yǎng)4周后禁食12～14 h，予STZ 30 mg·kg-1腹腔注射。1周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1即造模成功，繼續(xù)高脂飲食。取40只成模大鼠隨機(jī)分為4組：模型對(duì)照組，靈芝多糖組，二甲雙胍組，聯(lián)合用藥組，每組10只。靈芝多糖組給予靈芝多糖600 mg·kg-1；二甲雙胍組給予二甲雙胍600 mg·kg-1；聯(lián)合用藥組給予靈芝多糖300 mg·kg-1，二甲雙胍300 mg·kg-1。靈芝多糖溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na)溶液中，二甲雙胍溶解于純凈水。每日上午11：00時(shí)灌胃給藥一次，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續(xù)給藥12周。

1.5 血糖測(cè)定 給藥前及給藥12周末，禁食14～16 h后，經(jīng)尾靜脈取血，血糖儀測(cè)空腹血糖。

1.6 血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)測(cè)定 尾靜脈取血，2 000 r·min-1離心15min，分離血清，測(cè)定血清TC、TG含量。

1.7 血清SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平測(cè)定 均按試劑盒說(shuō)明書上操作要求進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常對(duì)照組大鼠外觀狀態(tài)良好，行動(dòng)自如。模型對(duì)照組大鼠一般情況差，飲水量、飲食量、尿量明顯增多，體型消瘦，皮毛雜亂無(wú)光澤，表現(xiàn)出典型的三多一少癥狀，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡大鼠5只，其中模型對(duì)照組死亡3只，二甲雙胍組死亡2只。靈芝多糖和二甲雙胍均能減輕大鼠的糖尿病癥狀，但聯(lián)合用藥組較單獨(dú)用藥組外觀改善更為明顯。

2.2 空腹血糖 實(shí)驗(yàn)前，3組用藥組血糖與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型對(duì)照組空腹血糖水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)后，3組用藥組空腹血糖水平均低于模型對(duì)照組(P<0.01)，其中聯(lián)合用藥組血糖顯著低于單獨(dú)用藥組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠實(shí)驗(yàn)前后空腹血糖水平比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.01；與單獨(dú)用藥組比較，*3P<0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01；compared with single medication group，*3P<0.01

2.3 大鼠血清TC和TG水平 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清TC、TG水平明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，用藥組血清TC、TG水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)；與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清TC、TG水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠血清TC和TG檢測(cè)值比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01；與單獨(dú)用藥組比較，*4P<0.01，*5P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01；compared with single medication group，*4P<0.01，*5P<0.05

2.4 大鼠血清SOD和MDA水平 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清SOD水平明顯降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.01)；與單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組血清SOD水平明顯升高(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清MDA水平明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，用藥組血清MDA水平明顯降低(P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清MDA較單獨(dú)用藥組明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 5組大鼠血清SOD和MDA檢測(cè)值比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.01；與單獨(dú)用藥組比較，*3P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01；compared with single medication group，*3P<0.05

2.5 大鼠血清CAT和GSH-Px水平 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清CAT、GSH-Px水平明顯降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，用藥組血清CAT、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，聯(lián)合用藥組血清CAT、GSH-Px水平較單獨(dú)用藥組明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 5組大鼠血清CAT和GSH-Px檢測(cè)值比較

與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01；與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01；與單獨(dú)用藥組比較，*4P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01；compared with single medication group，*4P<0.05

3 討論

近年來(lái)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，過(guò)氧化物生成增多或抗氧化物質(zhì)不足與糖尿病并發(fā)癥有密切關(guān)系[4]。且有研究證實(shí)氧化應(yīng)激是糖尿病慢性并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一[5]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失去平衡，或外源性氧化劑的過(guò)量攝入導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)堆積引起細(xì)胞毒性[6]。

干預(yù)氧化應(yīng)激既可從病因上著手，如恢復(fù)血糖、血脂的水平；也可從病理的中間環(huán)節(jié)著手，如切斷氧化應(yīng)激的發(fā)生、消除氧化應(yīng)激產(chǎn)物等。MDA是不飽和脂肪酸氧化的終產(chǎn)物，其含量的高低可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。因此，測(cè)定MDA水平可間接反映細(xì)胞受氧化損傷程度，是反映氧化應(yīng)激較好的指標(biāo)[7]。同時(shí)氧化應(yīng)激的發(fā)生和發(fā)展與血清中TC、TG水平有關(guān)[8]。高糖、高脂均可刺激產(chǎn)生過(guò)氧化產(chǎn)物，過(guò)氧化產(chǎn)物損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞是糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵起步[9]。本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組大鼠血清MDA、TC、TG含量顯著升高，3組治療組血清MDA、TC、TG含量顯著下降，且聯(lián)合用藥組比單獨(dú)給藥組下降更明顯。SOD、CAT、GSH-Px是體內(nèi)有效的自由基清除劑，它們的催化活性對(duì)維持氧化平衡系統(tǒng)非常重要[10]。在體內(nèi)高糖環(huán)境下，機(jī)體一方面清除氧自由基的酶(SOD、CAT，GSH-Px)活性降低，另一方面體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，造成大量活性氧自由基在體內(nèi)的積聚，導(dǎo)致活性氧連鎖反應(yīng)，從而促進(jìn)糖尿病一系列并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[11]。本研究中，模型對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈SOD、CAT和GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)。聯(lián)合用藥組的CAT和GSH-Px活性顯著升高(P<0.01)，效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組(P<0.05)，提示在總劑量不變的前提下，靈芝多糖和二甲雙胍聯(lián)合使用能減少TC、TG和MDA含量，降低血脂水平，抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激的形成，較單獨(dú)用藥組能更好增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

本實(shí)驗(yàn)在2型糖尿病大鼠模型中，靈芝多糖和二甲雙胍通過(guò)降低血清中TC、TG含量，增強(qiáng)體內(nèi)清除氧自由基酶的含量來(lái)減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激的形成。聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖和二甲雙胍在對(duì)抗糖尿病機(jī)體氧化應(yīng)激的效果方面明顯優(yōu)于單用。在總劑量不變的情況下聯(lián)合兩種藥物可以減少其中一種藥物的劑量。本研究中聯(lián)合用藥減少二甲雙胍的劑量，同時(shí)也降低二甲雙胍對(duì)降血糖可能帶來(lái)的不良反應(yīng)，并降低大鼠的死亡率。聯(lián)合使用靈芝多糖和二甲雙胍可能會(huì)成為今后臨床治療糖尿病及其并發(fā)癥的一個(gè)新方向。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.004

Effect of Ganoderma Lucidum Polysaccharides Combined with Metformin on Oxidative Stress of Type 2 Diabetic RatsinVivo

QIAO Jin1，DOU Zhihua1，SHI Zhong1，WU Feng2，MENG Guoliang2，CHEN Hui3，ZHEN Huihua3

(1.DepartmentofPharmacy，theThirdPeople’sHospitalofNantongCity,Nantong226001,China； 2.DepartmentofPharmacology,MedicalCollege,NantongUniversity，Nantong226001,China； 3.JiangsuAnhuiBiologicalTechnologyCo.Ltd,Nantong226006,China)

Objective To study the effect of ganoderma lucidum polysaccharides combined with metformin on oxidative stress of type 2 diabetic rats. Methods SD rats were fed with high fat diet for 4 weeks and injected with streptozotocin (30 mg·kg-1) to produce type 2 diabetic model.The diabetic rats were randomly divided into diabetes model group, ganoderma lucidum polysaccharides group (600 mg·kg-1), metformin group (600 mg·kg-1), combination group (ganoderma lucidum polysaccharides 300 mg·kg-1+ metformin 300 mg·kg-1), After 12 weeks of treatment, the level of fasting blood glucose was determined, and the activity of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were detected. Results The levels of fasting blood glucose in the treatment groups were significantly lower than that in the diabetes model group (P<0.01).Furthermore, fasting blood glucose in the combination group was significantly lower than that in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.01).Compared with diabetes model group, serum TC and TG in the treatment groups were significantly lower (P<0.05,P<0.01).Serum TC and TG were significantly lower in the combination group than in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05,P<0.01).Compared with diabetes model group, serum SOD levels in the treatment groups were significantly higher (P<0.01).Compared with ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group, serum SOD levels in the combination group was significantly higher (P<0.05).Compared with diabetes group, serum MDA levels in the treatment groups were significantly lower (P<0.01).Serum MDA in the combination group was significantly lower than that in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05).Compared with diabetes model group, serum CAT and GSH-Px in the treatment groups were significantly higher (P<0.05,P<0.01).Serum CAT and GSH-Px in the combination group were significantly higher than those in ganoderma lucidum polysaccharides group and metformin group (P<0.05). Conclusion Ganoderma lucidum polysaccharides combined with metformin could effectively inhibit oxidantion stress in type 2 diabetic rats.The effect was better than ganoderma lucidum polysaccharides or metformin used alone.The possible mechanism may be related to increased activity of SOD, CAT, GSH-Pxinvivoand regulation of dyslipidemia.

Ganoderma lucidum polyccharide； Metformin； Diabetes mellitus； Oxidative stress

2014-05-08

2014-08-05

*科技部十一五國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題項(xiàng)目(2006DAI06A20-02)；江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目

喬進(jìn)(1985-)，男，江蘇揚(yáng)州人，主管藥師，碩士，主要從事心血管藥理及臨床藥理研究。電話：(0)13901485175，E-mail：felix_jo@163.com。

竇志華(1966-)，男，江蘇南通人，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，博士，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新中藥研究。電話：0513-85116078，E-mail：zhihuadou@163.com。

R977.15；R965；R589

A

1004-0781(2015)06-0718-04