朱　江(綜述)，馬　潔(審校)

(天津市康婷生物工程有限公司生物醫(yī)學(xué)研究院，天津 300385)

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脂肪干細(xì)胞聯(lián)合富血小板血漿修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨研究進(jìn)展

朱江※(綜述)，馬潔(審校)

(天津市康婷生物工程有限公司生物醫(yī)學(xué)研究院，天津 300385)

摘要：關(guān)節(jié)軟骨容易受到損傷，而且缺乏自我修復(fù)的能力，傳統(tǒng)治療方法效果并不理想。隨著再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明，自體脂肪干細(xì)胞聯(lián)合富血小板血漿(PRP)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨療效顯著。干細(xì)胞是尚未分化的原始細(xì)胞，在一定條件下可以向骨、軟骨和脂肪等細(xì)胞分化；PRP是高度濃縮的血小板提取物，含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子。將干細(xì)胞與PRP聯(lián)合應(yīng)用，雙重強(qiáng)化了關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用，且來(lái)源自體，安全可靠。

關(guān)鍵詞：脂肪干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；富血小板血漿；關(guān)節(jié)軟骨；生長(zhǎng)因子

關(guān)節(jié)軟骨是一種高度分化的組織，一旦受到損傷，其自身修復(fù)能力非常有限，因?yàn)樗鼰o(wú)神經(jīng)支配，亦無(wú)血管分布，祖細(xì)胞無(wú)法到達(dá)患處，而且周圍的軟骨細(xì)胞也不能遷移至患處產(chǎn)生修復(fù)基質(zhì)。輕微的軟骨損傷能夠發(fā)展成為大范圍的骨性關(guān)節(jié)炎，治療難度很大，特別是年輕患者，不宜做關(guān)節(jié)置換。臨床上用于治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的外科手術(shù)主要分為兩類：一類側(cè)重于緩解癥狀，例如軟骨下鉆孔等；另一類側(cè)重于徹底修復(fù)，如自體/異體軟骨移植等。隨著再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，研究者嘗試?yán)酶杉?xì)胞作為種子細(xì)胞，再配合富血小板血漿(plated-rich plasma,PRP)中豐富的細(xì)胞因子，修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，臨床效果顯著?，F(xiàn)就脂肪干細(xì)胞聯(lián)合PRP修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的研究進(jìn)展予以綜述。

1多向分化潛能的脂肪干細(xì)胞

1.1干細(xì)胞的概念干細(xì)胞是一類未分化的，能夠自我復(fù)制更新的，具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，根據(jù)其來(lái)源的不同，可以分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。理論上，胚胎干細(xì)胞來(lái)自于受精卵，具有全能性，可以分化為三胚層的任何一種組織，然而在實(shí)際研究應(yīng)用中受到了宗教、政治和倫理等諸多因素的限制。成體干細(xì)胞在個(gè)體出生后，仍然保持未分化及穩(wěn)定狀態(tài)，被激活后可以向多種方向的細(xì)胞組織增生和分化，因此又被稱之為多能干細(xì)胞。在身體的很多組織中含有大量的成體干細(xì)胞，脂肪和骨髓是其主要的來(lái)源。

與骨髓一樣，脂肪組織起源于中胚層，含有大量的微血管網(wǎng)絡(luò)，包括胞外基質(zhì)和血管周圍間質(zhì)等，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有非常廣闊的應(yīng)用前景。理想的干細(xì)胞種子應(yīng)該滿足以下條件：①含量豐富；②獲取方法盡可能對(duì)身體造成較小的創(chuàng)傷；③能夠通過(guò)常規(guī)的且可重復(fù)的途徑向多方向分化；④能安全、有效的移植[1]。

1.2脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,AD-SCs)的優(yōu)勢(shì)早在20世紀(jì)90年代，研究者發(fā)現(xiàn)一些與肌肉骨骼組織相關(guān)的祖細(xì)胞參與了結(jié)締組織的修復(fù)，由于它們可以向間質(zhì)組織分化，而且是組織修復(fù)過(guò)程中非常重要的元素，1991年Caplan[2]首次將其定義為“間充質(zhì)干細(xì)胞”(mesenchymal stem cells,MSCs)。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為骨髓富含MSCs，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織也含有相當(dāng)數(shù)量的MSCs，而且同樣具有纖維樣形態(tài)、集落形成能力、特異免疫表型(CD44+，CD73+，CD90+，CD105+，CD14-，CD34-，CD45-)、易分離和多向分化等特點(diǎn)[3-6]。嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，脂肪組織中除了含有大量的MSCs以外，在細(xì)胞外基質(zhì)中還含有脂肪前體細(xì)胞(祖細(xì)胞)、外膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，它們?cè)诮M織修復(fù)中都扮演了重要的角色，所以統(tǒng)稱為AD-SCs，而不僅僅是脂肪MSCs(adipose-derived MSCs，AD-MSCs)。研究者認(rèn)為，脂肪是一個(gè)復(fù)雜的組織，相比骨髓而言，不僅更容易獲取，而且含有更多數(shù)量的未分化的MSCs，是骨髓的500～1000倍[7]。另外，脂肪是天然的活性生物支架，為干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化營(yíng)造良好的微環(huán)境。

1.3AD-SCs的研究AD-SCs參與修復(fù)多種類型的細(xì)胞損傷，例如軟骨損傷、骨關(guān)節(jié)炎血管再生、肌腱損傷、韌帶損傷、椎間盤損傷、心肌缺血、移植物抗宿主病以及成骨不全癥等。研究者在犬[8]、兔[9]、馬[10]、鼠[11]等動(dòng)物身上做了大量的實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)也做了大量的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明，AD-SCs極大地改善了關(guān)節(jié)軟骨功能，而且無(wú)不良反應(yīng)[12]。

2富含生長(zhǎng)因子的PRP

2.1PRP的概念PRP是指血小板濃度超過(guò)正常生理濃度數(shù)倍的血漿濃縮物，一般認(rèn)為其濃度應(yīng)至少高于生理全血濃度4倍才能達(dá)到有效治療濃度[13]。正常外周血僅含有6%的血小板，即每毫升含有大約2500個(gè)。而在高濃度PRP中，其濃度可高達(dá)94%，即每毫升含有大約10 000個(gè)血小板。根據(jù)含有白細(xì)胞的多少又可以將PRP分為貧白細(xì)胞PRP和富白細(xì)胞PRP。后者有更好的抗炎作用，因?yàn)榘准?xì)胞釋放出的遞質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)包括炎性細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞聚集和黏附，利于組織修復(fù)。所以該文研究的是富白細(xì)胞PRP。根據(jù)應(yīng)用形式，又可將PRP分為未激活PRP和激活PRP，后者通常具有凝膠和提取物等形態(tài)。血小板被激活釋放生長(zhǎng)因子的同時(shí)，釋放出的纖維蛋白原聚合為纖維蛋白，連接成網(wǎng)狀，形成肉眼可見的凝膠狀，有一定的黏附性和強(qiáng)度，可以作為種子細(xì)胞生長(zhǎng)依附的支架，在組織工程學(xué)中有廣泛應(yīng)用。而PRP提取物是指血小板活化后釋放入血漿或血清中含有的生長(zhǎng)因子和活性蛋白的上清液，可以作為種子細(xì)胞的溶劑或者培養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物。

2.2PRP作用機(jī)制早在20世紀(jì)90年代，PRP應(yīng)用于外科手術(shù)中，加速傷口愈合。當(dāng)時(shí)設(shè)備龐大，造價(jià)昂貴，且只能在醫(yī)院手術(shù)室中開展。最近10年，設(shè)備越來(lái)越小，成本越來(lái)越低，在普通的潔凈房間內(nèi)就能實(shí)施治療，所以PRP的臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為血小板在凝血止血方面發(fā)揮著重要的作用。而實(shí)際上，這只是其中一個(gè)功能。血小板中含有大量的重要的信號(hào)蛋白、生長(zhǎng)因子、化學(xué)因子、細(xì)胞因子和其他生物活性因子，例如血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、類胰島素生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[14]，它們能夠啟動(dòng)和調(diào)節(jié)一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終起到修復(fù)組織和愈合傷口的作用[15]。而且，一定濃度的血小板還可以激活間質(zhì)細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞，使其增殖、分化和遷移至損傷部位。

2.3PRP制備方法美國(guó)食品藥品管理局認(rèn)證并商業(yè)化生產(chǎn)的PRP制備系統(tǒng)有9種[16]，其中部分制備系統(tǒng)能快速、穩(wěn)定地獲得PRP。但在國(guó)內(nèi)，這樣的裝置并不多，多采用開放式二次離心法制備?；驹硎菍⒉杉耐庵苎ㄟ^(guò)離心，分為3層，上層為上清液，下層為紅細(xì)胞，中間淺黃色層即為PRP。

從2010年起，世界反興奮劑組織禁止肌肉應(yīng)用PRP，同時(shí)要求其他的應(yīng)用方法也必須符合治療應(yīng)用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。所以，局部注射PRP是否對(duì)整體產(chǎn)生影響[17]，臨床應(yīng)用PRP有無(wú)不良反應(yīng)，還有待進(jìn)一步研究。

3AD-SCs聯(lián)合PRP修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨

該方法起源于20世紀(jì)30年代，當(dāng)時(shí)采用葡萄糖來(lái)治療肌肉骨骼損傷，效果良好。到21世紀(jì)初，研究者開始嘗試應(yīng)用PRP或者干細(xì)胞來(lái)治療，取得了一定的成果。后來(lái)，將干細(xì)胞特別是AD-SCs和PRP聯(lián)合應(yīng)用，效果顯著。2013年，Koh等[18]對(duì)18例膝關(guān)節(jié)損傷的患者進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，觀察AD-SCs聯(lián)合PRP的治療效果，結(jié)果顯示該方法緩解了疼痛，提高了膝關(guān)節(jié)功能。

3.1理想的種子細(xì)胞庫(kù)AD-SCs為結(jié)締組織和關(guān)節(jié)修復(fù)提供了種子細(xì)胞庫(kù)。研究表明[19]，AD-SCs能夠激活成纖維細(xì)胞，使其增殖、遷移以及分泌膠原蛋白等，增強(qiáng)結(jié)締組織的韌性強(qiáng)度，促進(jìn)其愈合。如前所述，AD-SCs有分化為軟骨、肌腱、韌帶、骨骼和肌肉等組織的能力，并且能夠分泌多種生長(zhǎng)因子，影響和控制著損傷區(qū)域周圍的細(xì)胞[20]。所以，當(dāng)傳統(tǒng)的葡萄糖療法或者PRP療法治療不甚理想時(shí)，嘗試干細(xì)胞療法是不錯(cuò)的選擇。

3.2良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境高濃度PRP為組織修復(fù)營(yíng)造了良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。高濃度PRP含有大量的生長(zhǎng)因子，能夠激活肌肉骨骼自我修復(fù)能力，這對(duì)于骨組織修復(fù)至關(guān)重要，特別是肌腱的早期修復(fù)[21]。而且，AD-SCs的增殖和分化與PRP的濃度息息相關(guān)。高濃度PRP能夠釋放大量的血小板衍生生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和其他生長(zhǎng)因子，能夠顯著提高干細(xì)胞增殖和血管再生能力。

3.3立體微環(huán)境脂肪為干細(xì)胞生存和發(fā)揮作用提供了立體的微環(huán)境，細(xì)胞與細(xì)胞之間一系列復(fù)雜的物理、化學(xué)信號(hào)的傳遞影響著干細(xì)胞的功能和狀態(tài)[22]，因此未分化的間質(zhì)細(xì)胞一定要依附于其他細(xì)胞才能夠有效的增殖和分化。2010年，Little等[23]將AD-MSCs植入一個(gè)模擬的由韌帶成分和膠原凝膠構(gòu)成的韌帶基質(zhì)中，成功地證明了細(xì)胞向韌帶組織分化，而且基因和表型表達(dá)與韌帶一致。Albano和Alexander[24]報(bào)道,將富含MSCs和活性生物支架的自體脂肪組織成功修復(fù)了髕骨肌腱撕裂。

3.4獲取AD-SCs吸脂的部位大多在腹部或者側(cè)腹，吸脂的方法有多種[25]。2013年，Van Pham等[26]利用無(wú)菌注射器抽吸40～80 mL脂肪組織，通過(guò)試劑盒(AD-SCs Extraction kit,GeneWorld,Vietnam)提取分離出基質(zhì)血管層細(xì)胞，經(jīng)過(guò)離心、洗滌和消化等步驟，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)擴(kuò)增。2011年，Alderman 等[27]利用TulipTM裝置獲得5～20 mL脂肪組織，經(jīng)簡(jiǎn)單處理但無(wú)需培養(yǎng)擴(kuò)增。是否需要培養(yǎng)擴(kuò)增，取決于研究者的理論、治療所需要的細(xì)胞數(shù)量以及當(dāng)?shù)氐恼叻ㄒ?guī)等。

3.5注射方法不同的臨床醫(yī)師依據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)和理論會(huì)有不同的注射方法。Alderman等[27]在超聲的引導(dǎo)和定位下，利多卡因局部麻醉，通過(guò)螺口注射器和穿刺針將AD-SCs和PRP混合物注射到損傷部位，組織釋放出凝血酶和其他調(diào)節(jié)因子激活PRP，并且吸引生長(zhǎng)因子和AD-SCs向損傷部位聚集。利多卡因?qū)τ诟杉?xì)胞的活性是否有影響一直存在爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步研究。

經(jīng)國(guó)內(nèi)外研究者多次臨床試驗(yàn)證明，自體AD-SCs聯(lián)合PRP修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨是安全而有效的。評(píng)價(jià)該方法應(yīng)從以下3點(diǎn)考慮：①方法安全、有效；②簡(jiǎn)單易行，在門診區(qū)內(nèi)就可以完成；③符合當(dāng)?shù)氐恼叻ㄒ?guī)。盡管有很多文獻(xiàn)報(bào)道了干細(xì)胞療法的諸多優(yōu)點(diǎn)，但是臨床界內(nèi)并沒有形成統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的操作方法和指南，因此在治療方法、治療效果和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等方面存在很大差異。

另外，在干細(xì)胞來(lái)源方面，不同的研究者也有各自不同的見解。MSCs主要存在于骨髓、脂肪以及臍帶等組織中。Centeno等[28]利用骨髓MSCs治療膝關(guān)節(jié)炎效果顯著?？紤]到抽取骨髓的過(guò)程使患者感到痛苦，臍帶又來(lái)源于異體存在安全風(fēng)險(xiǎn)，所以脂肪干細(xì)胞受到更多研究者的青睞，不僅獲取方法簡(jiǎn)單，而且其數(shù)量也是骨髓的近千倍。但也有研究指出，AD-SCs大量表達(dá)和分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α，阻止軟骨細(xì)胞再生[29]。

4結(jié)語(yǔ)

關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)一直是臨床上尚未解決的難題，傳統(tǒng)治療方法效果并不理想。脂肪干細(xì)胞和PRP的聯(lián)合應(yīng)用為臨床醫(yī)學(xué)界提供了一個(gè)新的思路和有效的治療方法。具有多向分化潛能的種子細(xì)胞，在多種生長(zhǎng)因子的滋養(yǎng)下，在立體的微環(huán)境中，增殖分化，修復(fù)損傷的結(jié)締組織。其療效還有待更多的臨床病例觀察和確認(rèn)，其方法和標(biāo)準(zhǔn)還需要更多的研究者統(tǒng)一和制訂。但是有理由相信，再生醫(yī)學(xué)發(fā)展具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Adipose-derived Stem Cells Combined with Platelet-rich Plasma for Injured Articular CartilageZHUJiang,MAJie.(BiomedicalResearchInstitute,KangtingBiotechnologyCo.Ltd,Tianjin300385,China)

Abstract:Articular cartilage is vulnerable to damage,and lack of the ability of self-repair.Traditional treatments are not ideal.With the development of regenerative medicine and tissue engineering,more and more studies show that the method combining autologous adipose-derived stem cells with platelet-rich plasma(PRP) for injured articular cartilage has remarkable effect.Stem cells are primitively undifferentiated cells which can differentiate into the bone,cartilage and fat cells under certain conditions;PRP is a highly concentrated platelet extract containing a variety of cell growth factors.The joint application doubly strengthens the effect of articular cartilage repairing,and is safe and reliable because of the autologous resources.

Key words:Adipose-derived stem cells; Mesenchymal stem cells; Platelet-rich plasma; Articular cartilage; Growth factors

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-01-17編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.016

中圖分類號(hào)：R684.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)14-2535-03