朱義超，孫　潔,修光輝，潘興華(綜述)，凌　斌※，朱光旭(審校)

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，昆明 650021； 2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床實驗科，昆明 650032)

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多器官功能障礙綜合征動物模型制作方法新進(jìn)展

朱義超1△，孫潔1,修光輝1，潘興華2(綜述)，凌斌1※，朱光旭2(審校)

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，昆明 650021； 2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床實驗科，昆明 650032)

摘要：多器官功能障礙綜合征(MODS)是當(dāng)今危重癥醫(yī)學(xué)研究的重點，因病死率極高，研究其發(fā)病機(jī)制是有效治療的根本，建立可重復(fù)性經(jīng)濟(jì)標(biāo)準(zhǔn)的動物模型是研究的基礎(chǔ)。國內(nèi)外對MODS的研究方向不同，所依據(jù)的模型制作原理也不盡相同，因此其動物模型的制作方法也有較大差別。該文對MODS的相關(guān)動物模型制作方法及優(yōu)缺點予以綜述，為相關(guān)實驗研究提供參考。

關(guān)鍵詞：多器官功能障礙綜合征；動物模型；全身炎癥反應(yīng)綜合征；休克

多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是危重癥醫(yī)學(xué)中極其常見的一種臨床綜合征，是指在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克、大手術(shù)、病理產(chǎn)科及心肺復(fù)蘇等狀態(tài)下，機(jī)體同時或相繼發(fā)生兩個或兩個以上器官系統(tǒng)功能衰竭的臨床綜合征，病死率極高。盡管現(xiàn)今醫(yī)學(xué)技術(shù)已有了極大提高，但MODS患者的病死率仍達(dá)30%～40%，且隨器官衰竭數(shù)量增多而增高[1]。作為臨床上的急重癥，其誘發(fā)因素較多，治療措施也較為復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制也是目前研究的重點。然而成功的模型是進(jìn)行發(fā)病機(jī)制、治療措施等研究的關(guān)鍵[2]，近來對于MODS動物模型的綜合性研究報道較為稀少，現(xiàn)綜合國際上MODS相關(guān)的各類研究，針對MODS動物模型的制作方法進(jìn)行綜述。

1MODS發(fā)病機(jī)制概述

MODS的發(fā)病過程較為復(fù)雜，因此其發(fā)病機(jī)制也較為復(fù)雜，目前主要有“缺血-再灌注”“細(xì)菌毒素”“基因誘導(dǎo)”“炎癥失控”等假說。早在20世紀(jì)90年代，人們就已經(jīng)認(rèn)識到，失控性炎癥反應(yīng)是MODS的主要機(jī)制之一，全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是MODS發(fā)病的基礎(chǔ)，細(xì)胞因子失控性釋放是SIRS向MODS轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[3-4]，但具體的調(diào)控機(jī)制以及作用原理至今不明。因此,如何建立較為標(biāo)準(zhǔn)的動物模型成為前提，只有建立既簡便經(jīng)濟(jì)又可重復(fù)性強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)實驗動物模型，才能更好地對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，從而探索更好的治療措施，降低病死率，提高治愈率。

2MODS模型的判斷依據(jù)

目前國際上MODS的評判主要通過測定動物造模前后相應(yīng)的器官功能的生理生化指標(biāo)來評估[5]。通過造模前后對比，利用統(tǒng)計學(xué)方法分析其前后各數(shù)據(jù)的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。心血管及循環(huán)系統(tǒng)用心率、平均動脈壓、肌酸激酶及同工酶、乳酸脫氫酶來代表其功能，相應(yīng)的肺功能及呼吸系統(tǒng)用呼吸頻率或動脈血氧分壓及血二氧化碳分壓代表，腎臟及泌尿系統(tǒng)用血肌酐、尿素氮以及尿量代表，肝臟、胃腸以及消化系統(tǒng)由轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、胃腸活動、腸鳴音等代表，脾臟以及血液、免疫系統(tǒng)由凝血功能、白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)等代表。除此之外，還應(yīng)觀察動物的基本情況，如體質(zhì)量變化、體溫變化、精神狀態(tài)等。由于近來對SIRS誘發(fā)MODS的作用機(jī)制較為關(guān)注，各類炎性因子(如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6等)水平的測定也成為其參考的指標(biāo)，這些因子均在造模后顯著升高[6]。其各臟器的病理切片以及免疫組織化學(xué)結(jié)果也可證實各臟器的損傷情況[2]。

胡森等[7]在20世紀(jì)90年代即對MODS的動物模型做過系統(tǒng)的研究，他們根據(jù)人的SIRS診斷標(biāo)準(zhǔn)做出動物SIRS的評定參考動物SIRS的診斷依據(jù)：心率>2倍對照值，呼吸頻率>2倍對照值或動脈血二氧化碳分壓<75%對照值，直腸溫度較對照值±0.8 ℃，白細(xì)胞計數(shù)>2倍對照值或<50%對照值。他們還認(rèn)為，一個符合臨床實際的理想的 MODS實驗?zāi)Ｐ蛻?yīng)具備的標(biāo)準(zhǔn)是：致傷因素與臨床MODS常見誘因基本一致；發(fā)病在致傷24 h后；有SIRS的表現(xiàn)；有2個以上器官或系統(tǒng)的功能障礙；有足夠的發(fā)病率和病死率。

由于所用動物的各項功能隨飼養(yǎng)品種、飼養(yǎng)的不同也有較大差異，國際上目前也沒有較為統(tǒng)一的動物生理指標(biāo)參考，因此對MODS的判定結(jié)合目前國際主流評定方法，最好采取同等條件下的動物，取造模前后的血液標(biāo)本和各項生理指標(biāo)來做對比，對于差異有統(tǒng)計學(xué)意義的即可認(rèn)為其臟器有功能異常，有兩個及以上的臟器功能指標(biāo)提示異常后即可認(rèn)定MODS模型符合標(biāo)準(zhǔn)。

3國際常見的MODS實驗動物模型制作

目前國際上通用的，比較常見的MODS動物模型主要有以下幾種。

3.1出血休克模型Yang等[8]通過向大鼠股動脈置管，放掉血容量的40%來模擬出血性休克，失血后的48 h之內(nèi)，連續(xù)記錄評價動脈壓和心率，同時輸入等容積的生理鹽水作為液體復(fù)蘇。休克后1、24、48 h檢測生化指標(biāo)、腫瘤壞死因子α以及白細(xì)胞介素6的水平。休克后48 h,取腎、肝、肺和小腸做病理學(xué)檢測。出血性休克模型是針對“缺血-再灌注”假說提出的制作方法，出血性休克通過復(fù)蘇后會引起一些炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，其中腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6等都將會引發(fā)MODS。該方法較好地模擬了臨床失血性休克、創(chuàng)傷后引發(fā)的器官損傷，但此方法對于休克程度的把握要依靠相應(yīng)的生理轉(zhuǎn)換儀進(jìn)行血壓、心率等循環(huán)的監(jiān)測；動物的大動、靜脈置管操作一方面方便放血、回輸，另一方面還要能有效監(jiān)測循環(huán)功能。失血量的計算和控制是模型制作成敗的關(guān)鍵，此類方法較為適用于體型較大、血容量較為充足的動物，如兔、豬、犬、猴等。

3.2腸缺血-再灌注模型腸缺血-再灌注模型是鑒于“缺血-再灌注”假說制作模擬的，該方法主要是通過夾閉動物的腸系膜上動脈40～60 min后進(jìn)行液體復(fù)蘇模擬腸缺血-再灌注而引發(fā)的MODS[9]。Zanoni等[10]認(rèn)為，腸缺血和再灌注損傷的大鼠模型是關(guān)于腸系膜微循環(huán)以及菌群遷移方面在體實驗相對理想的模型，而且該模型平衡了MODS發(fā)生和死亡兩個事件的關(guān)聯(lián)。該模型的制作方法較為一致，可重復(fù)性較好，但對動物的創(chuàng)傷較大，要進(jìn)行較大的開腹、關(guān)腹操作，需注意操作的規(guī)范以及開腹之后的保溫工作，比較適用于大鼠、小鼠這類體型較小的動物，體型較大的動物的圍術(shù)期管理較為復(fù)雜，包括麻醉的維持時間的掌控、術(shù)中生命體征的維護(hù)等，而小型動物相對來說則易于控制。

3.3盲腸結(jié)扎穿孔模型目前國際上運用較多的MODS模型中盲腸結(jié)扎穿孔占了較大比例，該法通過結(jié)扎盲腸后并造成其穿孔來復(fù)制膿毒癥模型[11]，各項生化指標(biāo)檢測前后均顯著升高且大腦皮質(zhì)、肝、肺、血管系統(tǒng)的組織病理學(xué)也均有損傷變化[12]。Daudel等[13]研究認(rèn)為，微循環(huán)障礙是導(dǎo)致組織缺氧和敗血癥多器官功能衰竭的重要因素。該方法綜合了創(chuàng)傷與腸黏膜缺血的雙重打擊誘發(fā)器官損傷，在一定程度上也是模擬了一種臨床急重癥的發(fā)展誘發(fā)的MODS，是對于缺血-再灌注模型的進(jìn)一步改進(jìn)，包含腸黏膜的缺血損傷以及膿毒癥打擊。此模型制作也需開腹手術(shù)，并確認(rèn)盲腸位置進(jìn)行結(jié)扎、穿刺等操作，需要研究者對各類動物的解剖結(jié)構(gòu)較為了解，有一定難度，但此類方法手術(shù)時間較短，對麻醉和圍術(shù)期管理要求較低，適用于各類動物。

3.4大腸埃希菌脂多糖模型依據(jù)“細(xì)菌毒素”的假說，模擬膿毒癥的臨床發(fā)展來引發(fā)MODS是近年來做的較多的模型，由于只需向大鼠體內(nèi)腹腔或靜脈注射脂多糖即可，操作方便，Collin等[14]按照不同的脂多糖濃度(6 mg/kg、20 mg/kg)分組靜脈注射，模擬制作了嚴(yán)重內(nèi)毒素血癥的大鼠，大鼠在6 h 后肝臟出現(xiàn)損傷和功能障礙。Asakura等[15]通過大鼠尾靜脈4 h內(nèi)注射脂多糖(30 mg/kg)或靜脈持續(xù)輸注脂多糖1 mg/(kg·10 min) 10 min來制作大鼠彌散性血管內(nèi)凝血模型。為了提高M(jìn)ODS的成功率，很多學(xué)者又對此進(jìn)行了改進(jìn)，結(jié)合了以往的一些方法，如Niu等[16]復(fù)制了兩次打擊模型，包括腸系膜血管夾閉和脂多糖的雙重打擊。兩次打擊后，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐和 乳酸脫氫酶1顯著升高。Qiao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈兩次打擊注射脂多糖(98 μg/kg、196 μg/kg)可以重建伴隨多器官損傷的大鼠彌散性血管內(nèi)凝血模型。但此方法的不足之處即是限于各種動物的質(zhì)量以及實驗條件，所用的脂多糖劑量差別較大，為6～30 mg/kg 不等，這與大腸埃希菌脂多糖的種類及批次、注射方式、動物狀態(tài)等都有關(guān)，因此各研究者在做此模型時需要進(jìn)行前期的摸索，針對所用動物和實驗條件制訂一個適合自己研究的劑量和方法。

3.5酵母多糖誘發(fā)炎癥模型近年來越來越多的研究表明SIRS是MODS的關(guān)鍵，因此誘發(fā)SIRS的動物模型能較好地向MODS方向發(fā)展。Goris等[18]在20世紀(jì)80年代就創(chuàng)建了酵母多糖誘發(fā)炎癥模型，即酵母多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥模型。將酵母多糖粉劑用高頻磁力攪拌器溶解于液體石蠟中混勻1 h 后100 ℃水浴80 min消毒滅菌，冷卻37 ℃即可按照1 mg/g 的劑量向大鼠或小鼠進(jìn)行腹腔注射。該模型動物在進(jìn)展中，肝、腎尤其是肺和脾臟的干濕重隨著病理組織的變化而出現(xiàn)漸變性的變化，老年大鼠比成年大鼠MODS的表現(xiàn)更為嚴(yán)重和提前[19]，肺臟、肝臟以及小腸的損傷可以通過生化檢測以及組織學(xué)分析判斷[4]。Volman等[20]對之前單純的酵母多糖打擊方案作了進(jìn)一步的改進(jìn)，首先進(jìn)行脂多糖(40 μg)腹腔注射，6 d后腹腔注射酵母多糖(1 mg/g)可以降低在休克第一階段的死亡率，利于MODS的發(fā)展。近些年，該模型的酵母多糖用量有所降低，大部分的用量在0.50～0.75 mg/kg[21]。酵母多糖誘發(fā)炎癥模型現(xiàn)已經(jīng)被大量地用于研究多器官衰竭，該模型也因其所用試劑劑量國內(nèi)外較為統(tǒng)一，且所引起的MODS各項指標(biāo)變化與人類臨床發(fā)病特點相似，被認(rèn)為是與人類MODS最為類似的動物模型[21-22]。該模型的缺陷也是其優(yōu)勢所在，即酵母多糖誘發(fā)炎癥模型的制作較臨床發(fā)病過程有一定偏差，但其也能夠排除其他所有的臨床病癥，直接過渡到全身炎癥失控性爆發(fā)這個層面引發(fā)MODS，對于MODS在炎癥爆發(fā)以及各類炎性因子的作用調(diào)控方面的研究較為有利。

3.6其他MODS模型除以上所述各類動物的MODS模型外，還有一些其他制作方法，Lutmer等[23]報道了用燒傷來誘發(fā)MODS進(jìn)行研究，去除小鼠體表面積的25%毛發(fā)后進(jìn)行燒傷處理，也觀察到了多臟器的功能障礙，主要是引起了肺臟的急性損傷。Wang等[24]利用延遲的水母咬傷綜合征原理，通過使用水母素的提取物制作了延遲性水母咬傷綜合征模型，發(fā)現(xiàn)也能對各靶器官造成損傷，形成MODS。但這些模型的制作缺乏較多的實驗支持，其模型的穩(wěn)定性有待驗證。

4展望

當(dāng)今對于MODS動物模型的制作并無固定統(tǒng)一的做法，但在制作過程中應(yīng)注意標(biāo)準(zhǔn)的動物模型能夠較好地反映臨床發(fā)病特點，所用動物的遺傳同源性也應(yīng)盡可能接近于人，小鼠與人的同源性可以達(dá)到80%，大鼠的更是達(dá)到89%～90%[25]。模擬相關(guān)重大疾病創(chuàng)傷引發(fā)MODS的模型較為傳統(tǒng)，通過引發(fā)膿毒癥而引發(fā)MODS的模型，是更接近于MODS臨床發(fā)生的一種做法，酵母多糖誘發(fā)的MODS模型則是對新階段SIRS引發(fā)MODS理論的最好研究對象，排除了其他干擾因素，直接從引發(fā)全身性炎癥出發(fā)。未來對于MODS的研究，或許會更傾向于兩方面的考慮：①盡量模擬臨床發(fā)病過程的膿毒癥模型；②更純粹的機(jī)制模擬的酵母多糖模型。

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New Progress in Modeling Methods of Multiple Organ Dysfunction SyndromesZHUYi-chao1,SUNJie1,XIUGuang-hui1,PANXing-hua2,LINGBin1,ZHUGuang-xu2. (1.TheIntensiveCareUnitDepartment,theFourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650021,China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory，KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryCommandofChinesePLA，Kunming650032，China)

Abstract：Multiple organ dysfunction syndrome(MODS) is the focus of the critically ill study,due to the high mortality,the study of its pathogenesis is fundamental to find effective treatment and to establish repeatable and economic standard animal model is the basis of the research.The direction of research on MODS is different at home and abroad,and the basis of the model making the models is not all the same,therefore the model making methods are varied considerably as well.Here is to make a review of the MODS animal modeling approaches and their advantages and disadvantages,so as to provide a reference for the experiment and research.

Key words:Multiple organ dysfunction syndrome; Animal models; Systemic inflammatory response syndrome; Shock

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-01-08編輯：伊姍

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81360289，81170316)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.003

中圖分類號：R363

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)14-2502-04