張麗霞(綜述)，邵世峰(審校)

(國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市海河醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300350)

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結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性所致的基因耐藥與表型耐藥不一致的研究進(jìn)展

張麗霞(綜述)，邵世峰※(審校)

(國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市海河醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300350)

摘要：結(jié)核病治療和防治是全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，治療中抗結(jié)核藥物的不規(guī)范使用,加上患者的依從性差，造成了結(jié)核菌耐藥率不斷增高，成為目前治療上的難題之一。結(jié)核菌耐藥有多種原因，其中異質(zhì)性是結(jié)核菌耐藥的一個(gè)微小變化過(guò)程。臨床檢驗(yàn)中由于常規(guī)方法的局限性無(wú)法檢測(cè)頻率過(guò)低的菌株而造成耐藥結(jié)果的偏差，出現(xiàn)了同一標(biāo)本不同方法藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致的現(xiàn)象，提示結(jié)核分枝桿菌的異質(zhì)性對(duì)藥敏結(jié)果有影響。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；異質(zhì)性耐藥；表型耐藥；基因耐藥

當(dāng)前，耐藥性問(wèn)題是結(jié)核病最重要的問(wèn)題之一,特別是耐多藥結(jié)核病、嚴(yán)重耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)給結(jié)核病的治療帶來(lái)了更大的困難[1]。世界衛(wèi)生組織估計(jì)約2/3的結(jié)核病患者處于耐多藥的危險(xiǎn)之中[2]。所以，藥敏試驗(yàn)的正確判斷和耐藥監(jiān)測(cè)對(duì)結(jié)核病控制和流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)起著重要作用。因此，研究結(jié)核菌耐藥機(jī)制，掌握各種檢測(cè)方法的特性，快速、準(zhǔn)確地給臨床提供治療依據(jù)是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室工作者追尋的目標(biāo)。傳統(tǒng)的結(jié)核菌檢測(cè)方法具有金典性，但隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核菌快速鑒定和藥敏試驗(yàn)為患者治療提供了更為有利的條件。目前結(jié)核耐藥基因技術(shù)已走向臨床，對(duì)結(jié)核患者進(jìn)行快速篩查和藥敏分析已成為必然趨勢(shì)，現(xiàn)就基因耐藥和表型耐藥結(jié)果不一致現(xiàn)象予以綜述。

1結(jié)核分枝桿菌基因的研究

傳統(tǒng)的結(jié)核菌基因分型技術(shù)以核酸為主，從表型特征上認(rèn)識(shí)細(xì)菌，主要有噬菌體分型、血清分型、藥物敏感試驗(yàn)分型、細(xì)胞蛋白電泳、生物化學(xué)多樣性分析等。隨著科技的進(jìn)步和方法學(xué)的變化，目前多采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)、可變串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)、單核苷酸多態(tài)性分析、長(zhǎng)片段多態(tài)性等來(lái)分析。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法具有較高的分辨率和菌株鑒別的能力；間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)是基于染色體上直接重復(fù)區(qū)位點(diǎn)的多態(tài)性，方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性高、只需少量DNA，被公認(rèn)為北京家族菌株鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[3]；可變串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)被美國(guó)疾病預(yù)防中心推薦為結(jié)核分枝桿菌基因分型的首選方法，其操作簡(jiǎn)便、快速、成本低，以聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)，也被稱為可變串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)[4]。目前采用的線性探針檢測(cè)技術(shù)可檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌的rpoB、katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA以及編碼外排泵蛋白質(zhì)的efpA、iniA、iniB、 iniC基因等[5]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)日趨成熟，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的基因及耐藥機(jī)制進(jìn)行了更加深入的研究，定位了結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的位置、基因突變位點(diǎn)和藥物的關(guān)系來(lái)判斷耐藥性，使人們對(duì)結(jié)核病的流行特點(diǎn)和傳播有了更深刻的理解和掌控。

2耐藥的概念、機(jī)制與檢測(cè)方法

2.1耐藥的概念及機(jī)制結(jié)核病分為直接感染耐藥結(jié)核菌引起的原發(fā)耐藥和結(jié)核分枝桿菌菌株基因組發(fā)生突變而產(chǎn)生的獲得性耐藥[6]。原發(fā)性耐藥指從未因結(jié)核病而被治療過(guò)的患者，或曾因結(jié)核病被治療過(guò)但少于1個(gè)月的患者，他們帶有一種或多種抗結(jié)核藥物耐藥結(jié)核分枝桿菌；而獲得性耐藥是指結(jié)核患者開(kāi)始接受抗結(jié)核藥物治療后，在治療過(guò)程中結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生一種或多種抗結(jié)核藥物的耐藥性[7]。目前結(jié)核桿菌發(fā)生耐藥的機(jī)制可從細(xì)胞水平與分子水平來(lái)分析，細(xì)胞水平的耐藥機(jī)制與結(jié)核桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥概率、療效、病灶中細(xì)菌數(shù)量及藥物種類的應(yīng)用有直接的關(guān)系，病灶中結(jié)核桿菌數(shù)量越大，突變概率越大，耐藥的機(jī)會(huì)也越多[8]。單一用藥耐藥的概率大于聯(lián)合用藥，用藥數(shù)量越多、耐藥的機(jī)會(huì)越少，耐多藥結(jié)核病的發(fā)生率也越低[9]；分子水平上的耐藥機(jī)制與細(xì)胞膜通透性、產(chǎn)生降解或滅活酶類、藥物的作用靶位相關(guān)[10]。另外，染色體突變介導(dǎo)的藥物靶編碼基因的各種突變基因，是結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要分子機(jī)制[11]。

2.2檢測(cè)方法目前我國(guó)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的方法主要有傳統(tǒng)的固體檢測(cè)法(包括比例法、絕對(duì)濃度法和耐藥性法)和現(xiàn)代的快速培養(yǎng)儀系統(tǒng)(常用的有全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)儀、全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及顯微鏡觀察藥物敏感性檢測(cè))[12]；近代的線性探針技術(shù)、基因芯片測(cè)序等技術(shù)也逐步應(yīng)用于結(jié)核病快速診斷和耐藥基因突變的臨床檢測(cè)中[13]。各種方法都有各自的敏感性和特異性，由于操作者不同而存在較大差異。絕對(duì)濃度法在判斷上未對(duì)“敏感”和“耐藥”下明確定義，僅記錄培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)的豐度來(lái)報(bào)告，結(jié)果不直觀，人為因素多，給藥敏試驗(yàn)室間質(zhì)控帶了困難；相比之下，比例法對(duì)藥物敏感試驗(yàn)中接種量進(jìn)行了校準(zhǔn)，它采用了兩種菌液濃度(10-2mg/mL和10-4mg/mL)，通過(guò)計(jì)算活性單位的比值獲得，使結(jié)果更加精準(zhǔn)，定義1%為“敏感”和“耐藥”的臨界點(diǎn)[14]。全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)/藥敏系統(tǒng)是目前常用的液體快速檢測(cè)方法，該方法在分枝桿菌生長(zhǎng)指示管底部包埋熒光感應(yīng)器，對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)溶解的氧氣敏感，加入標(biāo)本孵育后若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)大量的氧氣抑制熒光感應(yīng)器發(fā)出熒光，儀器檢測(cè)為陰性；如有細(xì)菌生長(zhǎng)則消耗培養(yǎng)基內(nèi)氧氣，激活熒光感應(yīng)器發(fā)出熒光，儀器檢測(cè)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，儀器檢測(cè)為陽(yáng)性，一般在標(biāo)本培養(yǎng)后的4～12 d內(nèi)報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果。自動(dòng)液體培養(yǎng)系統(tǒng)比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基顯示了較好的敏感性和檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)[15-16]。但由于藥敏種類少不能更好地滿足臨床需求，不能有效篩查嚴(yán)重耐藥結(jié)核病菌株，所以也同時(shí)使用傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)法對(duì)二線藥及氟喹諾酮藥物的監(jiān)測(cè)，因此也就出現(xiàn)了在實(shí)際工作中遇到的同一標(biāo)本，同一種藥物兩種方法藥敏結(jié)果判斷不一致的現(xiàn)象。對(duì)此，O′Grady等[17]報(bào)道，通過(guò)不同藥敏測(cè)試方法在檢測(cè)時(shí)間、準(zhǔn)確性、實(shí)用性、菌液濃度等方面的比較得出，結(jié)果不符的原因可能與菌株低水平的耐藥有關(guān)，也可能是因?yàn)樵摼渲心退幒兔舾械膩喨罕壤煌?。宿主的多態(tài)性、結(jié)核菌敏感和耐藥的數(shù)量或菌種的異質(zhì)性是造成細(xì)菌是否耐藥的主要原因[18-19]。

3結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的產(chǎn)生

異質(zhì)性耐藥是指在同一標(biāo)本中同時(shí)存在敏感菌和耐藥菌的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了細(xì)菌群體從部分耐藥向完全耐藥的微小轉(zhuǎn)變過(guò)程。臨床標(biāo)本中存在同一患者相同時(shí)間分離的標(biāo)本液體法和固體法藥敏結(jié)果不一致的現(xiàn)象，究其原因是實(shí)驗(yàn)室污染、多重感染、異質(zhì)性耐藥、檢測(cè)方法問(wèn)題或是細(xì)菌本身對(duì)藥物敏感性不均一問(wèn)題，這些問(wèn)題的存在對(duì)結(jié)核病的耐藥性診斷及治療提出了挑戰(zhàn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)同一患者同次送痰的兩種方法藥敏結(jié)果不一致的菌株進(jìn)行分析的文獻(xiàn)還較少，有學(xué)者報(bào)道用高通量測(cè)序技術(shù)研究了結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的發(fā)展過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在異煙肼耐藥性產(chǎn)生的早期同一細(xì)菌菌體中同時(shí)存在4～5種與異煙肼耐藥相關(guān)的突變，證明了異質(zhì)性耐藥的真實(shí)存在[20-21]。

4研究異質(zhì)性耐藥結(jié)核分枝桿菌的臨床意義

異質(zhì)性耐藥是從敏感菌向耐藥菌轉(zhuǎn)變的過(guò)程，研究異質(zhì)性耐藥能加深對(duì)耐藥結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的認(rèn)識(shí)，異質(zhì)性耐藥標(biāo)志著細(xì)菌突變數(shù)量的多少和用藥劑量的大小。在進(jìn)行耐藥性評(píng)價(jià)時(shí)，不僅要考慮到方法學(xué)的差異，還應(yīng)考慮是否存在多重感染、繼發(fā)感染及混合感染等。因此，臨床上在進(jìn)行藥物敏感性監(jiān)測(cè)時(shí)要選擇靈敏性高的診斷方法，對(duì)耐藥菌特別是適應(yīng)性高的耐藥菌篩查要注意方法的敏感性，盡早采用先進(jìn)的基因技術(shù)預(yù)測(cè)藥物的敏感性，避免異質(zhì)性耐藥的出現(xiàn)造成結(jié)果的偏差和誤導(dǎo)治療方案的確立；同時(shí)，了解其耐藥程度，采取個(gè)體化用藥，真正有效控制耐藥結(jié)核病的傳播，防止和延緩結(jié)核菌向耐多藥、嚴(yán)重耐藥發(fā)展。另外，異質(zhì)性耐藥又存在于結(jié)核菌初始變化過(guò)程中，研究異質(zhì)性耐藥對(duì)評(píng)估結(jié)核病療效也具有重要意義。對(duì)結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的認(rèn)識(shí)以及是否在臨床中采取不同的治療措施[22]，在細(xì)菌群體數(shù)量較少的時(shí)候進(jìn)行個(gè)體化治療，來(lái)降低耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，還有待大量臨床數(shù)據(jù)的支持和研究[23-25]。

5小結(jié)

比例法、絕對(duì)濃度法和全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)/藥敏系統(tǒng)、全自動(dòng)血培養(yǎng)檢查系統(tǒng)以及顯微鏡觀察藥物法、線性探針、基因測(cè)序、結(jié)核分枝桿菌/核酸檢測(cè)等技術(shù)都在不同階段為結(jié)核病的控制和治療起著重要作用。異質(zhì)性耐藥是細(xì)菌對(duì)抗抗生素的一個(gè)效應(yīng)過(guò)程，也是對(duì)治療方案的選擇、療效評(píng)價(jià)的一個(gè)驗(yàn)證。研究結(jié)核菌的異質(zhì)性耐藥，必將為早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病、減緩結(jié)核菌耐藥起到積極作用。

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Research Progress of Inconsistent Results Caused by the Heterogeneity of Mycobacterium Tuberculosis Gene and Phenotypic Drug ResistanceZHANGLi-xia，SHAOShi-feng.(KeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControlofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinHaiheHospital，Tianjin300350，China)

Abstract：Tuberculosis(TB) treatment and prevention is a global public health problem,due to the irregular use of anti-TB drugs,plus poor compliance of the patients,TB drug resistance is increasing continuously,and has become one of the difficulties in clinical.There are many causes of TB drug resistance,and heterogenicity is a small change process,where clinical testing cannot detect low frequency drug-resistant strains because of the limitations of conventional methods,resulting in inconsistent results of the same specimen by different tests,which indicates heterogeneity influences on the drug sensitivity test.

Key words:Mycobacterium tuberculosis; Heterogeneous resistance; Phenotypic resistance; Gene resistance

收稿日期：2014-10-29修回日期：2015-01-16編輯：鄭雪

基金項(xiàng)目：天津市衛(wèi)生局課題(2014K2035)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.012

中圖分類號(hào)：R446.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)14-2526-03