梁曉玲,王世斌

(解放軍北京軍區(qū)太原藥品器材供應(yīng)站,山西 太原 030012)

纖溶酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死的預(yù)防作用及對(duì)血漿血栓前體蛋白的影響

梁曉玲,王世斌

(解放軍北京軍區(qū)太原藥品器材供應(yīng)站,山西 太原 030012)

目的 觀察纖溶酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠的預(yù)防作用及對(duì)血栓前體蛋白(TpP)水平的影響。方法 將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及纖溶酶低、中、高劑量組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組均建立腦梗死模型，其中纖溶酶低、中、高劑量組分別于手術(shù)前30 min經(jīng)尾靜脈給予纖溶酶1 ，2，4 IU/10 g，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。手術(shù)成功后6 h從心臟取血、測(cè)定血漿中TpP水平，取腦測(cè)定腦梗死體積。結(jié)果 纖溶酶低、中、高劑量組梗死面積百分比、TpP水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；纖溶酶高劑量組梗死面積和百分比明顯低于低劑量組(P<0.05),血漿TpP水平明顯低于中、低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論 纖溶酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死具有預(yù)防作用，并能降低TpP水平。

纖溶酶；血栓前體蛋白；纖維蛋白原；腦梗死

纖溶酶是應(yīng)用單克隆抗體純化技術(shù)制備的一類新型降纖藥[1]，可以改善患者臨床癥狀，預(yù)防血栓的發(fā)生和發(fā)展，可用于腦梗死、心肌梗死、下肢深靜脈血栓等血栓性疾病的預(yù)防和治療。血栓前體蛋白(TpP)是纖維蛋白原形成血栓前的中間過(guò)渡體，在腦梗死患者中，TpP在梗死3 h內(nèi)就達(dá)到正常值的3～5倍，這為腦梗死早期診斷與及時(shí)溶栓提供了可靠的臨床依據(jù)[2]；在血栓性疾病,尤其急性冠脈綜合征[3]、腦梗死[4]的早期診斷中具有重要意義。在腦梗死早期診斷中，TpP比影像學(xué)CT[5]、磁共振更具優(yōu)勢(shì)[6]。而在其他血栓類疾病中，如下肢深靜脈栓塞[7]、腫瘤[8]、彌散性血管內(nèi)凝血[9]等，TpP也有著特殊的診斷意義。臨床中纖溶酶可有效防治血栓類疾病的發(fā)生發(fā)展，但纖溶酶是否能通過(guò)自身活性作用降解TpP尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察了纖溶酶預(yù)防大鼠實(shí)驗(yàn)性腦梗死的作用及對(duì)TpP的影響，旨在為其臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 主要試劑和儀器 注射用纖溶酶(北京賽升藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：201305171)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(E.MERCK公司)；TpP酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測(cè)試劑盒(上海迪奧生物科技有限公司)；分光光度計(jì)；Bioelisa Reader Elx800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bioelisa 公司)；ThromboScreen400C血凝儀(美國(guó)太平洋公司)；全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量180～250 g，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、纖溶酶低、中、纖溶酶高劑量組，每組10只。

1.3 模型制備及組給藥 纖溶酶低、中、高劑量組分別于手術(shù)前30 min經(jīng)尾靜脈給予注射用纖溶酶1，2，4 IU/10 g，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。PE-50導(dǎo)管(外徑0.3 mm，內(nèi)徑0.2 mm)經(jīng)一軟管接微量加樣器，手術(shù)前充滿凝血酶(1×106IU/L)。各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉30～40 mg/kg麻醉，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈、左側(cè)頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈。頸動(dòng)脈分叉遠(yuǎn)端7～10 mm處結(jié)扎頸外動(dòng)脈、翼腭動(dòng)脈，使頸內(nèi)動(dòng)脈成為頸總動(dòng)脈唯一供血?jiǎng)用}。微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈。導(dǎo)管經(jīng)頸外動(dòng)脈距分叉處3 mm處插入，并進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，移走頸內(nèi)動(dòng)脈上的微動(dòng)脈夾，繼續(xù)插入15 mm，抽取10 μL動(dòng)脈血進(jìn)入導(dǎo)管，停留10 min以形成栓子。暫時(shí)用微動(dòng)脈夾夾閉對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈，然后將凝血酶連同栓子注入頸內(nèi)動(dòng)脈，5 min后移走右側(cè)頸總動(dòng)脈上的微動(dòng)脈夾；10 min后拔出導(dǎo)管，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈近端；15 min后移走左側(cè)頸總動(dòng)脈上的微動(dòng)脈夾，縫合皮膚。假手術(shù)組手術(shù)操作和結(jié)扎動(dòng)脈與手術(shù)組相同，但導(dǎo)管內(nèi)充滿生理鹽水，不在導(dǎo)管內(nèi)形成栓子。

1.4 TpP濃度測(cè)定 手術(shù)成功6 h后從大鼠心臟取血2 mL，收集于含肝素抗凝劑的試管中，血液與抗凝劑比例為9：1。全血標(biāo)本于室溫放置2 h，1 000 r/min離心20 min，取上清液,按照ELISA法進(jìn)行TpP濃度測(cè)定。加樣時(shí)設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL。加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 ℃反應(yīng)120 min。棄去液體，甩干。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100 μL(取1 μL生物素標(biāo)記抗體加99 μL生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前1 h內(nèi)配制)，37 ℃反應(yīng)60 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μL/每孔，甩干。 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液) 100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色，30 min內(nèi)如肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3～4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3～4孔梯度不明顯，即可終止。依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。在加終止液后15 min用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.5 TTC染色 心臟取血后，斷頭處死SD大鼠，取腦。去除嗅球、小腦和低位腦干，-20 ℃冷凍20 min，第一刀從腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處取冠狀面開(kāi)始切片，第二刀在視交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間，以保證均勻切成5片，每片約2 mm厚。腦片置于2%TTC液中，37 ℃避光溫箱中放置30 min，再將腦片置10%福爾馬林溶液中固定。

1.6 腦梗死面積百分比測(cè)定 缺血后，梗死區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞缺血壞死，還原性輔酶Ⅱ(NADPH)喪失，不能將TTC還原，該區(qū)域腦組織呈灰白色；而正常腦組織內(nèi)NADPH還存在，將氧化型TTC還原為還原型，該區(qū)域呈現(xiàn)紅色，從而可區(qū)分梗死區(qū)與正常區(qū)。用眼科鑷分離蒼白區(qū)(梗死區(qū))和非蒼白區(qū)(正常區(qū))，利用ImageJ2X圖像分析軟件計(jì)算腦梗死面積百分比。計(jì)算公式：梗死百分比(%)=蒼白區(qū)面積/(蒼白區(qū)面積+非蒼白區(qū)面積)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦梗死面積比較 手術(shù)6 h后，模型組、纖溶酶低劑量組、纖溶酶中劑量組、纖溶酶高劑量組腦梗死面積百分比分別為(30.75±6.23)%,(13.12±5.26)%,(10.60±4.01)%和(5.31±2.53)%。纖溶酶低劑量組、纖溶酶中劑量組、纖溶酶高劑量組腦梗死面積百分比均明顯低于模型組(P均<0.01)。纖溶酶中劑量組和纖溶酶低劑量組腦梗死面積百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。纖溶酶高劑量組腦梗死面積百分比明顯低于纖溶酶低劑量組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠TpP水平比較 手術(shù)6 h后假手術(shù)組、模型組、纖溶酶低劑量組、纖溶酶中劑量組、纖溶酶高劑量組TpP水平分別為(5.34±1.22)μL/mL，(46.09±10.52)μL/mL，(29.10±6.31)μL/mL，(23.96±4.25)μL/mL，(12.33±4.02)μL/mL。模型組TpP水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；纖溶酶低、中、高劑量組TpP水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，纖溶酶中劑量組與纖溶酶低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，纖溶酶高劑量組TpP水平明顯低于纖溶酶低、中劑量組(P均<0.05)。

3 討 論

血栓形成有3大原因：內(nèi)皮損傷、血流減慢以及血液成分改變。正常大鼠內(nèi)皮既不會(huì)損傷，血流也不會(huì)減慢，因此本研究采用改變血液成分方法，從頸外動(dòng)脈注射凝血酶，促進(jìn)大鼠體內(nèi)凝血，在注射凝血酶前，回抽少量血液形成血栓，血栓在凝血酶前進(jìn)入血管，減緩血流速度促進(jìn)血栓形成，并且注射后還通過(guò)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈以最大限度阻止血流對(duì)凝血酶的稀釋；此外，還結(jié)扎了左側(cè)頸外動(dòng)脈與翼腭動(dòng)脈，使頸內(nèi)動(dòng)脈成為頸總動(dòng)脈唯一供血血管，從而保證血栓全部進(jìn)入腦循環(huán)，以最大化造成腦組織梗死，同時(shí)，以這種方法可以進(jìn)一步減少血栓栓子流入頸外動(dòng)脈或翼腭動(dòng)脈，避免造成實(shí)驗(yàn)誤差。

本研究TTC染色結(jié)果顯示，模型組大鼠灰質(zhì)、白質(zhì)均有明顯的白色區(qū)域，證實(shí)造模引起大鼠嚴(yán)重腦梗死，梗死面積達(dá)30%；纖溶酶呈劑量依賴性的降低大鼠腦梗死面積，也證實(shí)了纖溶酶可有效治療缺血性腦梗死，這與尹俊雄等[10]、王建等[11]的結(jié)論一致。

TpP是一種可溶性纖維蛋白多聚體，作為不溶性血栓的直接前體，是纖維蛋白原形成纖維蛋白的必經(jīng)階段。纖維蛋白原由2個(gè)亞基組成，亞基由α、β、γ 3條肽鏈組成，纖維蛋白原兩端結(jié)構(gòu)域稱為D區(qū)，中間結(jié)構(gòu)域稱為E區(qū)[12]。在凝血酶作用下，纖維蛋白原2條α鏈、β鏈氨基末端發(fā)生裂解，釋放出一對(duì)纖維蛋白肽A和一對(duì)纖維蛋白肽B,形成纖維蛋白單體。纖維蛋白礁A和纖維蛋白肽β的釋放會(huì)暴露中央?yún)^(qū)的聚合部位，這樣兩個(gè)纖維蛋白單體發(fā)生非共價(jià)結(jié)合形成不穩(wěn)定的復(fù)臺(tái)物。第三個(gè)纖維蛋白單體加入后能以同樣方式與其中之一單體相連，如此纖維蛋白單體通過(guò)分子間E-D區(qū)和D-D區(qū)的相互作用可形成雙股的初纖維。當(dāng)初纖維不斷交聯(lián)達(dá)到一定分子數(shù)量時(shí)，形成了不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白單聚體，即TpP，又稱可溶性纖維蛋白單體復(fù)合物(sFMC)[13]。TpP在凝血因子X(jué)Ⅲ和鈣離子作用下，相鄰分子之間的Gln與Lys之間形成共價(jià)鍵，并在纖維網(wǎng)表面結(jié)合α2-抗纖溶酶，纖維蛋白凝塊的黏度彈性大為增強(qiáng)，從而形成堅(jiān)固的不可溶的交聯(lián)纖維蛋白凝塊。

TpP是纖維蛋白原經(jīng)凝血酶作用而活化的產(chǎn)物，是血栓形成的最后門戶，是血栓形成過(guò)程中的一種重要標(biāo)志物，降低TpP水平可以直接抑制活動(dòng)性血栓的形成，防治梗死的發(fā)生。然而，人們?cè)?9世紀(jì)60年代才注意到TpP的存在，直到1978年，人們清楚地了解了纖維蛋白原形成血栓的過(guò)程變化，才真正認(rèn)識(shí)了TpP的真正含義以及它的分子組成[14]。由于纖維蛋白原的異質(zhì)性而包含了數(shù)百萬(wàn)種異構(gòu)體，并且纖維蛋白原的低抗原性更使得開(kāi)發(fā)纖維蛋白原抗體難度大大提高，至今仍未有一個(gè)精確地測(cè)量TpP濃度方法[15]。由于TpP的特殊意義，人們開(kāi)始了TpP抗體的開(kāi)發(fā)。Hamano等[16]研究發(fā)現(xiàn)一可識(shí)別在TpP C端區(qū)域的單克隆抗體，不僅可同纖維蛋白原及其降解產(chǎn)物區(qū)分，也可同TpP降解產(chǎn)物X’、Y’、E’片段區(qū)分，大大提高了TpP檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但遺憾的是該抗體仍未能大范圍應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)中所選試劑盒仍可能因TpP降解產(chǎn)物片段的影響而造成結(jié)果的偏差。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠TpP水平顯著升高，達(dá)到正常水平的9～10倍；纖溶酶呈劑量依賴性降低大鼠血漿TpP水平，纖溶酶高劑量組幾乎恢復(fù)至正常水平，這與腦梗死面積變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明纖溶酶通過(guò)降低TpP水平防止大鼠缺血性腦梗死，為血栓性疾病的診斷和治療提供了新的理論依據(jù)，但對(duì)于纖溶酶降解TpP的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Preventive effect of fibrinogenase on experimental cerebral infarction and the influence on plasma thrombus precursor protein

LIANG Xiaoling, WANG Shibin

(Taiyuan Medicinal Materials Supply Station of the Beijing Military Area Command of PLA, Taiyuan 030012, Shanxi, China)

Objective It is to observe the preventive effect of fibrinogenase on experimental cerebral infarction and the influence on the level of plasma thrombus precursor protein (TpP). Methods 50 SD rats were divided into sham-operation group, model group, and Low, Middle and High dose of fibrinogenase group with 10 rats in each; in which pre-operative treatment for 30 min, a single iv dose of 1, 2 and 4 IU/10 g of fibrinogenase was given for the three groups (Low dose group, Middle dose group, High dose group) respectively, and sham-operation group and model group were given normal saline as same capacity. At 6-hour after operation, the blood and brain were taken to measure the infarct area and the concentration of TpP. Results The percentage of cerebral infarction area of Low, Middle and High dose of fibrinogenase group was (13.12±5.26)%, (10.60±4.01)% and (5.31±2.53)% respectively, and for model group was (30.75±6.23)%. The concentration of TpP Low, Middle and High dose of fibrinogenase group was (29.10±6.31)μg/mL, (23.96±4.25)μg/mL and (12.33±4.02)μg/mL, for model group was (46.09±10.52)μg/mL. The percentage of cerebral infarction area and the levels of TpP of Low, Middle and High does of fibrinogenase group were significantly lower than those of model group (allP<0.05), and the percentage of cerebral infarction area of High does of fibrinogenase group was markedly lower than that of Low does of fibrinogenase group (P<0.05), and the TpP concentration was markedly lower than those of Middle and Low does of fibrinogenase group (allP<0.05). Conclusion Fibrinogenase has a preventive effect on cerebral infarction and can reduce the TpP concentration in blood.

fibrinogenase; thrombus precursor protein; fibrinogen; cerebral infarction

梁曉玲，女，主管技師，研究方向?yàn)樾哪X血管藥物、藥理的研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.007

R-332

A

1008-8849(2015)12-1273-03

2014-11-19