馬華林，張祥貴，楊 丹，孟令國

(1.廣東省深圳市人民醫(yī)院,廣東 深圳 518020；2.遵義醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院，廣東 珠海 519100)

商陸皂苷甲對BXSB小鼠狼瘡腎炎凋亡的影響

馬華林1，張祥貴2，楊 丹2，孟令國2

(1.廣東省深圳市人民醫(yī)院,廣東 深圳 518020；2.遵義醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院，廣東 珠海 519100)

目的 通過觀察商陸皂苷甲(EsA)對BXSB小鼠腎臟細胞凋亡的影響，探討EsA對狼瘡腎炎的作用機制。方法 將24只18周齡雄性BXSB小鼠隨機分為模型組、地塞米松組和EsA組，腹腔注射相應藥物治療4周后留取腎組織標本，采用原位末端標記法檢測腎臟細胞凋亡情況，免疫組化檢測組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL表達情況。結(jié)果 ①3組間腎小球和腎小管細胞的凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EsA組凋亡指數(shù)最高，其次為地塞米松組。②與模型組比較，兩治療組小鼠腎組織Bcl-2光密度值顯著下降(P<0.05)，EsA和地塞米松治療組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；3組間Bax的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而3組間腎組織Bcl-2/Bax的比值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。③與模型組比較，兩治療組BXSB小鼠的腎組織Fas、FasL 光密度值明顯增加(P<0.05)，EsA和地塞米松治療組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 EsA具有誘導BXSB小鼠腎小球和腎小管細胞凋亡作用,其通過下調(diào)BXSB小鼠腎組織中Bcl-2表達及上調(diào)Fas、FsaL表達而促進細胞凋亡的發(fā)生。

商陸皂苷甲；狼瘡腎炎；細胞凋亡

細胞凋亡過程是在一系列相關(guān)基因的有序調(diào)節(jié)和控制下進行的,而在參與細胞凋亡調(diào)控的相關(guān)基因中,目前研究較清楚的有Bcl-2家族、ced家族、Fas和p53等。目前認為，狼瘡腎炎(LN)的發(fā)生發(fā)展與腎臟細胞增殖和凋亡失衡關(guān)系密切，表現(xiàn)為細胞數(shù)量的異常增多，而細胞凋亡呈現(xiàn)絕對或相對不足，致使細胞增殖占據(jù)優(yōu)勢[1]。商陸皂苷甲(EsA)是從商陸塊根中提取的含量最高的皂苷[2],有其可能具有誘導細胞凋亡和抑制細胞增殖等多種功效[3]。本實驗通過動物模型觀察了EsA對LN腎臟細胞凋亡的影響并探討其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 選用系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型BXSB小鼠24只，雄性，體質(zhì)量(28±2)g，鼠齡18周，北京大學醫(yī)學部免疫學教研室提供。

1.2 動物分組 將24只小鼠編號按隨機數(shù)字表法分為模型組、地塞米松組及EsA組,每組8只。

1.3 藥品試劑 EsA粉劑(西安文陽貿(mào)易有限公司生產(chǎn)，批號：65497076)。地塞米松磷酸鈉注射液(廣州白云山制藥股份公司生產(chǎn)，1 mL/5 mg國藥準字H44022091)。

1.4 干預方法 模型組腹腔注射，RPMI1640培養(yǎng)液0.2 mL/d，地塞米松組腹腔注射地塞米松溶液1 mg/(kg·d)，EsA組腹腔注射EsA溶液20 mg/(kg·d)。每只小鼠均給藥1次/d，連續(xù)4周，終點為小鼠22周齡。

1.5 標本采集 乙醚麻醉后，處死小鼠，切開腹腔摘取腎組織，固定后石蠟包埋。將腎組織石蠟標本連續(xù)切成4μm，60 ℃烘干后，4℃存儲備用。

1.6 免疫組化法檢測 采用鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復合物法(SABC法)檢測BXSB小鼠腎組織Bax、Bcl-2、Fas、Fasl表達情況。Imagepro-plus 6.0軟件分析各組圖像，鏡下隨機取10個無重疊視野(×400倍視野)，相同的光強度下檢測出每個視野的Bax、Bcl-2、Fas、FasL累積光密度(IOD)及檢測面積(Area)，按照IOD/Area計算比值，即平均光密度值，該比值越大陽性表達越強，反之陽性弱。

1.7 TUNEL法檢測 通過原位末端標記法即TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡情況。每切片均在10×40倍視野下隨機選取10個無重復的腎小球或腎小管，計數(shù)每個腎小球或腎臟內(nèi)陽性細胞數(shù)以及固有細胞總數(shù)，以兩者比值計為凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組BXSB小鼠腎臟細胞凋亡情況 TUNEL陽性細胞在各組的腎組織中均可見到，主要存在于腎小管上皮細胞和腎小球內(nèi)細胞。模型組的腎小球和腎小管凋亡指數(shù)最低，其次是地塞米松組，EsA治療組最高。組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組腎小鼠小球及小管細胞凋亡指數(shù)比較

注：①與模型組比較，P<0.05；②與地塞米松組比較，P<0.05。

2.2 各組BXSB小鼠腎組織Bax Bcl-2表達及Bcl-2/Bax情況 各組腎組織中Bax、Bcl-2均有表達，腎小球內(nèi)細胞有少量表達，表達主要位于小管上皮細胞。EsA組和地塞米松組Bcl-5腎小管上皮細胞和腎小球內(nèi)細胞EsA組和地塞米松組表達與模型組比較均有所減弱。半定量結(jié)果顯示3組間Bax表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。而EsA組和地塞米松組腎組織Bcl-2光密度值明顯低于模型組(P<0.05)，EsA組和地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EsA組和地塞米松Bcl-2/Bax明顯低于模型組，EsA組低于地塞米松組。見表2。

表2 各組腎組織Bax、Bcl-2及Bcl-2/Bax光密度值比較

注：①與模型組比較，P<0.05;②與地塞米松組比較，P<0.05。

2.3 各組BXSB小鼠腎組織Fas和FasL表達情況 Fas和FasL蛋白在各組腎組織中均有表達，腎小球細胞和腎間質(zhì)細胞胞漿均可見Fas和FasL表達，地塞米松和EsA組腎小球內(nèi)和腎間質(zhì)細胞陽性表達較模型組均有所增強。與模型組比較，地塞米松組和EsA組Fas和Fas L光密度值明顯上升(P<0.05)；地塞米松組和EsA組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腎組織Fas和FasL光密度值比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

本研究經(jīng)TUNEL法檢測后發(fā)現(xiàn)地塞米松組和EAS組的腎小球和腎小管細胞凋亡指數(shù)較對照組明顯升高，且地塞米松組的效果與王建中等[4]的研究結(jié)果基本一致，表明EsA具有類似于地塞米松的誘導腎臟細胞凋亡作用。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，相對于LN患者腎組織中細胞的過度增殖，細胞凋亡明顯顯得不足，而Bcl-2在LN活動期腎小球內(nèi)高表達且與腎小球的增殖程度呈正相關(guān)，可以推測凋亡不足可能與Bcl-2的過度表達有關(guān)[5]。本研究結(jié)果顯示：相比于模型組，地塞米松組和EAS組腎組織Bcl-2光密度值明顯下降,提示EsA可能具有類似于激素(地塞米松)的作用，可通過下調(diào)Bcl-2，從而誘導LN細胞凋亡。Bax與Bcl-2正好相反，是Bcl-2家族中重要的促凋亡調(diào)節(jié)基因[6]，因此,Bax 和Bcl-2的比例可以決定細胞凋亡敏感性[7]。本研究結(jié)果顯示：相比于模型組，地塞米松組和EsA均對腎組織Bax表達無明顯影響。然而，結(jié)合各組Bcl-2∕Bax比值，可以推測EsA可能通過下調(diào)Bcl-2表達及Bcl-2∕Bax比值而非直接上調(diào)誘導凋亡蛋白Bax的表達發(fā)揮誘導細胞凋亡作用。

在自身免疫性疾病的腎臟損害中，F(xiàn)as/FasL 系統(tǒng)也受到廣泛關(guān)注[8-9]。Fas、FasL在腎小球和腎小管間質(zhì)細胞中均有表達，但在腎小球和腎小管間質(zhì)細胞的表達程度有所不同。Fas介導的死亡受體途徑在LN的發(fā)病過程中起了一定的作用[10]，當Fas或FasL基因表達缺陷或改變時，使模型小鼠出現(xiàn)狼瘡發(fā)病或使病情加重，在MRL/lpr[11]或MRL/gld[12]小鼠中均已證實；同樣在LN患者腎組織中也發(fā)現(xiàn)小球細胞和小管間質(zhì)細胞中有Fas、FasL表達[13]。而本研究結(jié)果顯示：相比于模型組，兩地塞米松組和EsA組小鼠的腎組織Fas、FasL光密度值明顯增強，這說明實驗劑量的EsA可能具有地塞米松類似的作用，可通過上調(diào)腎小球細胞和/或腎間質(zhì)細胞Fas、FasL蛋白的表達，從而改善LN病情。

綜上所述，EsA具有促進BXSB小鼠腎臟細胞凋亡作用。隨著凋亡紊亂在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病作用研究中的進一步深入，凋亡調(diào)節(jié)劑的運用具有重要的治療前景。

[1] Mortensen ES,Fenton KA,Rekvig OP.Lupus nephritis:the central of nucleosomes revealed[J].Am J Pathol,2008,172(2):275-283

[2] 馬杰.商陸皂苷的化學及2010版《中國藥典》商陸質(zhì)量標準的修訂研究[D].西安：西北大學,2010

[3] 鄧俐，張?zhí)玫?，杜?商陸皂苷甲對體外培養(yǎng)的人角質(zhì)細胞增殖的影響[J].中國皮膚性病學志,2006,20(11):655-657

[4] 王建中,廖洪軍,陳香美,等.甲基潑尼松龍對狼瘡小鼠腎臟細胞凋亡及ICE基因表達的影響[J].中華內(nèi)科雜志,1997,36(2):79-81

[5] Fathi N,Hussein MR,Hassen HI,et al.Glomerular expression and elevated serum Bcl-2 and Fas proteins in lupus nephritis:preliminary[J].Clin Experim Immunol,2006,146:339-343

[6] 肖振宇,鄭欽岳,張俊.商陸皂苷甲對小鼠胸腺細胞凋亡的影響[J].第二軍醫(yī)大學學報,2002,23(6):659-661

[7] Harrington HA,LHo KC,Ghosh S,et al.Construction and analysis of modular model of Caspase in apoptosis[J].Theoretical Biology and Medical Modelling,2008,5(26):1-3

[8] Singh R,Pradhan V,Patwardhan M,et al.Apo-1/Fas gene:structural and functional character in system lupus erythematosus and other autoimmune diseases[J].Indian J Humgenet,2009,15(3):98-102

[9] Xue C,Lanlan W,Bei C,et al.Abnormal Fas/FasL and Caspase-3 mediated apoptotic signaling pathway in patients in systemic lupus erythematosus[J].Celluar Immulogy,2006,239(2):121-128

[10] 李偉平.Survivin相關(guān)凋亡因子在狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展中的作用[D].廣州：中山大學，2008

[11] Komori H,Furukawa H,Mori S,et al.A signal adaptor SLAM-associated protein regulates spontaneous autoimmunity and Fas-dependent lympho-poliferation inMRL-Fas lupus mice[J].Immunology,2006,176:395-400

[12] Fields ML,Nish SA,Hondowicz BD,et al.The infuence of effector T Cells and Fas ligand on lupus-associated B cells[J].Immunology，2005，175:104-111

[13] Fathi NA,Hussein MR,Hassen HI,et al.Glomerular expression and elevated serum Bcl-2 and Fas proteins in lupus nephritis:preliminary finding[J].Clin Experim Immunol,2006,146:339-343

Effect of esculentoside A on apoptosis of lupus nephritis-prone BXSB mouse

MA Hualin1, ZHANG Xianggui2, YANG Dan2, MENG Lingguo2

(1.Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong, China; 2.The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zhuhai 519100, Guangdong, China)

Objective It is to observe the effects of esculentoside A (EsA) on the renal cell apoptosis of BXSB mouse, and explore the mechanism of ESA on Lupus nephritis.Methods 24cases of male BXSB mice at the age of 18 weeks were randomly divided into model group, EsA group and Dexamethasone group.The BXSB mice were treated by Sodium Chloride, ESA and Dexamethasone.Four weeks later, all mice were killed to obtain nephridial tissue.The apoptosis ratio of nephros cells was detected by in situ end labeling method, the expression of Bax, Bcl-2, Fas and FasL in nephridial tissue were detected by Immunohistochemical method.Results ①There was significant difference in apoptosis index of nephros cells among three groups (allP<0.05).The apoptosis index of EsA group was highest and Dexamethasone group was following.②The expression of Bcl-2 in kidneys of model group was significantly higher than that of EsA and Dexamethasone group (P<0.05); there was no significant difference between EsA and Dexamethasone group(P>0.05).There was no significant difference in the express of Bax among three groups (allP>0.05).There was significant difference among there groups in the ratio of Bcl-2/Bax (allP<0.05).③The expression of Fas and FasL in kidneys of model group was significantly lower than that of EsA and Dexamethasone group (P<0.05), there was no difference between EsA and Dexamethasone group (P>0.05).ConclusionEsA can degrade urine protein concentration and improve renal function, pathological kidney damage in BXSB mice.EsA can promote the apoptosis of nephros cell, and down regulation the expression of Bcl-2 and up regulation the expression of Fas and FasL in BXSB mice.

esculentoside A; lupus nephritis; cell apoptosis

馬華林，男，主治醫(yī)師，從事腎臟病的臨床與基礎(chǔ)研究工作。

張祥貴，E-mail: zxg5220@163.com

遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)科研啟動基金項目(KY200607)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.09.005

R-332

A

1008-8849(2015)09-0927-03

2014-10-30