李辰龍，王洪斌*，宋新剛，孫心

（1.東北農(nóng)業(yè)大動物醫(yī)學(xué)院黑龍江哈爾濱150030；2.哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

藍(lán)舌病病毒基因和蛋白的特點(diǎn)及利用

李辰龍1，王洪斌1*，宋新剛2，孫心2

（1.東北農(nóng)業(yè)大動物醫(yī)學(xué)院黑龍江哈爾濱150030；2.哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司黑龍江哈爾濱150069）

藍(lán)舌病病毒是引起綿羊、牛藍(lán)舌病的病原。該病毒是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA病毒，對其分子生物學(xué)特性的研究，可以闡明其致病機(jī)制和遺傳學(xué)規(guī)律，有助于藍(lán)舌病預(yù)防治療的研究。國內(nèi)對該病毒的研究起步較晚，本文簡述了藍(lán)舌病病毒基因結(jié)構(gòu)和蛋白特點(diǎn)及對其的利用，為預(yù)防及治療提供參考。

藍(lán)舌病病毒；基因蛋白；免疫預(yù)防

藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus,BTV）屬于呼腸孤病毒科、環(huán)狀病毒屬，是環(huán)狀病毒屬的代表種。綿羊?qū)TV最易感，牛、山羊和鹿亦可感染該病毒。BTV是引起家養(yǎng)和野生反芻動物藍(lán)舌病的病原體，幾乎完全通過特定種類庫蠓叮咬傳播[1]。藍(lán)舌病是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定報(bào)告疾病名錄中規(guī)定的A類傳染病。該病對畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重影響，導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國對BTV的研究起步較晚。本文簡述了藍(lán)舌病病毒基因結(jié)構(gòu)和蛋白特點(diǎn)及對其利用，為預(yù)防及治療提供參考。

1 BTV的分子結(jié)構(gòu)

BTV顆粒較大（直徑約70～80 nm），呈20面體對稱，無囊膜，由外層的核衣殼、核衣殼外的細(xì)絨毛狀層以及10個(gè)大小不一的雙股RNA基因片段組成。病毒顆粒的外層衣殼由VP2和VP5兩種主要蛋白構(gòu)成，內(nèi)層衣殼由VP3、VP7)兩種主要蛋白和VP1、VP4和VP6三種次要蛋白構(gòu)成[2]。

2 BTV的基因組

BTV的基因組為雙鏈、分節(jié)段RNA，以高度有序的形式存在于核芯中。BTV病毒有10個(gè)大小不一的雙股RNA片段組成。10個(gè)基因片段分別編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1-VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3a、NS3b)。10個(gè)獨(dú)立的RNA片段分別命名為L1-3、M4-6、S7-10除S10節(jié)段外每個(gè)節(jié)段編碼一種蛋白[3]。

3 BTV蛋白的功能

3.1 三種少量蛋白VP1、VP4、VP6

BTV病毒進(jìn)入易感細(xì)胞的過程中會脫去外層衣殼，形成由5種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP3、VP4、VP6和VP7)和10條基因組dsRNA組成的核芯顆粒。

VP1蛋白具有RNA依賴的RNA聚合酶活性[4-5]，表達(dá)的重組VP1蛋白在缺少其他核芯蛋白的情況下，依然可以有效地進(jìn)行RNA的合成；而且其不僅能以病毒自身的RNA為模板進(jìn)行RNA合成，還可以以外源RNA為模板合成RNA。但自然條件下，BTV的VP1蛋白不會以宿主RNA為模板進(jìn)行RNA合成。

VP4特異性識別病毒自身RNA的機(jī)制目前還不明確。

VP6蛋白富含賴氨酸和精氨酸，可以結(jié)合并催化dsRNA解螺旋，VP6蛋白核酸結(jié)合活性具有濃度依賴性，而且與構(gòu)象有關(guān)，其可以催化粘末端或平末端dsRNA解螺旋。VP6蛋白較保守，被認(rèn)為是一種群特異性抗原[6]。

3.2 四種衣殼蛋白VP2、VP3、VP5、VP7

3.2.1 兩種內(nèi)衣殼蛋白VP3、VP7分別有L3和S7節(jié)段編碼。

病毒的內(nèi)衣殼由VP3和VP7組成，包裹著3種少量蛋白和病毒基因組，是病毒的核心顆粒，同時(shí)VP3和VP7構(gòu)成的內(nèi)衣殼是外層衣殼組裝的基礎(chǔ)。2種蛋白都高度保守，屬群特異性抗原。

VP3蛋白在BTV病毒的衣殼成分中在最內(nèi)層，對維持病毒核芯顆粒結(jié)構(gòu)的完整性非常重要。VP3蛋白分為A和B兩種構(gòu)形，其化學(xué)組成完全相同，但有不同折疊方式。這種構(gòu)象上的微小差異使VP3蛋白形成閉合的亞核芯層結(jié)構(gòu)。VP3亞核芯層為VP7蛋白三聚體的附著提供了“腳手架”[7]。同時(shí)，VP3亞核芯層還與包裹的3種少量蛋白和基因組dsRNA緊密結(jié)合。VP3蛋白的保守性對于維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)非常重要。

VP7蛋白也具有保守性，這種保守性決定了病毒較強(qiáng)的群屬特異性，VP7蛋白在病毒的血清學(xué)診斷方面用來判定群屬性。VP7蛋白以三聚體形式組裝在VP3蛋白構(gòu)成的亞核芯層表面，形成內(nèi)衣殼的外層。BTV的VP7蛋白含有RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）三肽基序，位于蛋白的168～170 aa位，RGD基序是病毒在宿主體內(nèi)整合家族蛋白識別的一種配體位點(diǎn)，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜的吸附[8]。因此，VP7蛋白除了參與病毒顆粒的構(gòu)成，還可以與宿主細(xì)胞膜結(jié)合。但VP7蛋白是否直接參與病毒核心顆粒的穿膜尚不清楚。

2.1 各組心臟彩超檢測指標(biāo)對比 與正常組相比，模型組小鼠LVEF、LVFS、LVPWDd、LVPWDs降低，LVAWd、LVAWs、LVIDd、LVIDs升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，陽性組、黃芩莖葉黃酮組 LVEF、LVFS、LVPWDd、LVPWDs升高，LVAWd、LVAWs、LVIDd、LVIDs降低，具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

3.2.2 兩種外衣殼蛋白VP2、VP5

二十面體構(gòu)型的環(huán)狀病毒核芯顆粒被外衣殼所包繞，外衣殼由VP2和VP5兩種蛋白構(gòu)成。VP2和VP5蛋白分別由L2和M5節(jié)段編碼。

VP2蛋白是藍(lán)舌病病毒結(jié)構(gòu)蛋白中變異性最強(qiáng)的蛋白，其氨基酸序列的突變率為22.4%～73%。VP2蛋白位于病毒粒子的最外層，親水性強(qiáng)，包含可被中和的血凝抑制（HI）抗體識別的血清型特異性表位，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，雖然其部分抗原表位是保守的，但蛋白的突變改變了VP2蛋白的構(gòu)象，導(dǎo)致表位的空間位置發(fā)生改變，使抗體無法中和病毒。VP2的氨基端很強(qiáng)的變異性，可能決定著病毒存在很多種的血清型，具有種特異性。BTV的VP2蛋白具有血凝素活性，可以與宿主細(xì)胞表面的血型糖蛋白A相結(jié)合。

VP5蛋白分子以三聚體形式存在于病毒粒子的外層衣殼中，120個(gè)三聚體整齊分布于核芯顆粒的VP7上。VP5蛋的保守性較VP2蛋白強(qiáng)，不同血清型BTV間同源性為70%以上。同VP2蛋白一樣VP5蛋白也能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。但因VP5蛋白的同源性較高，所以產(chǎn)生的中和抗體特異性不強(qiáng)，具有群特異性，VP5蛋白的近氨基端處存在兩個(gè)“兩親性螺旋”，與蛋白的膜融合活性相關(guān)。VP5蛋白插入細(xì)胞膜中會破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜透性化[9-11]。

VP2和VP5組成的BTV的外衣殼蛋白可以引起細(xì)胞凋亡，但凋亡并不是由病毒的復(fù)制所引起，而是由病毒脫衣殼過程所引起。抑制內(nèi)體的酸化可以抑制這種促凋亡作用。

3.3 四種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3a、NS3b

目前，在BTV病毒感染的細(xì)胞中已經(jīng)檢測到了4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3a和NS3b)。4種非結(jié)構(gòu)蛋白在不同血清型BTV之間保守性很強(qiáng)[12]。非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒粒子的組裝和運(yùn)輸過程中起重要作用。

NS1蛋白與NS3蛋白表達(dá)量之比可能決定了病毒釋放方式。NS1蛋白介導(dǎo)病毒通過細(xì)胞裂解釋放，而NS3蛋白介導(dǎo)病毒通過出芽方式釋放。病毒釋放方式的不同決定了對細(xì)胞損傷程度的不同。

NS2蛋白是病毒包涵體(VIB)的主要成分，存在病毒感染的細(xì)胞中，主要分布于細(xì)胞核附近。病毒核心顆粒的組裝即發(fā)生在包涵體中。NS2蛋白可以被激酶催化磷酸化，磷酸化之后結(jié)合單鏈RNA的活性降低20%～30%，但磷酸化對于包涵體的形成是必須的[14]。

BTV的S10節(jié)段是基因組節(jié)段中最小的一個(gè)。S10基因的開放閱讀框中有2個(gè)保守的起始密碼子翻譯分別產(chǎn)生2種氨基酸組成相似的蛋白-NS3a和NS3b，其在病毒感染的細(xì)胞中兩種蛋白的表達(dá)量都很少。NS3a/NS3b蛋白翻譯后，通過高爾基體運(yùn)送至細(xì)胞膜，可以插入細(xì)胞膜中，破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，可能與BTV的致病性相關(guān)[15]。NS3a/NS3b可以介導(dǎo)病毒粒子的運(yùn)輸和釋放，來幫助病毒粒子的釋放[16]。

4 應(yīng)用

BTV可以在傳播媒介庫蠓等的昆蟲體內(nèi)，根據(jù)基因特點(diǎn)可以利用昆蟲體內(nèi)的RNA片段進(jìn)行復(fù)制繁殖，且病毒的流行具有地域性特點(diǎn)，某一種或幾種血清型的病毒只在固定的地區(qū)流行。

根據(jù)BTV基因結(jié)構(gòu)和蛋白，基因片段多，且不同片段特異性編碼復(fù)制一種蛋白的特點(diǎn)，可以制備基因缺失疫苗，把病毒產(chǎn)生致病性的基因剪切掉，制成基因缺失苗。如剪切掉控制VP5蛋白兩個(gè)“兩親性螺旋”合成的基因、剪切掉S10基因階段控制NS3a和NS3b蛋白合成的片段，然后將基因缺失的病毒在適合的細(xì)胞上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收獲后加入保護(hù)劑制成凍干活疫苗。接種免疫后即可以有效的對動物進(jìn)行保護(hù)，又避免了病毒在接觸傳遞過程中的返祖增強(qiáng)。

還可以把同一地區(qū)流行的幾種血清型的具有免疫原性的基因剪切合成在一起，制成基因重組的亞單位疫苗，這樣免疫后可以對當(dāng)?shù)亓餍械牟煌逍偷乃{(lán)舌病病毒，都可以起到預(yù)防作用。

根據(jù)BTV血清型區(qū)域流行的特點(diǎn)，可以將區(qū)域流行的血清型的病毒，制成基因缺失苗或亞單位合成苗的活疫苗后，對經(jīng)檢測藍(lán)舌病病毒陰性的動物，羊或牛進(jìn)行免疫，然后讓庫蠓等傳播媒介昆蟲叮咬，病毒在其體內(nèi)復(fù)制增殖，再叮咬其他動物就會對其進(jìn)行接種免疫。也可以直接對庫蠓等昆蟲進(jìn)行疫苗接種，然后再通過庫蠓對其他動物的叮咬進(jìn)行間接免疫。

5 總結(jié)

藍(lán)舌病病毒是結(jié)構(gòu)上最復(fù)雜的RNA病毒之一，由多種病毒蛋白和多節(jié)段的RNA基因組構(gòu)成，給研究工作帶來了較大的挑戰(zhàn)性。國外BTV分子生物學(xué)方面的研究起步較早，目前已經(jīng)可以通過RNA獲得具有感染性的病毒粒子，并正在通過反向遺傳技術(shù)對BTV的分子進(jìn)行更加直接和接近真實(shí)的研究。這種方法將成為BTV分子生物學(xué)研究中一種更加有效的工具。目前，對于BTV蛋白功能的研究還存在許多矛盾之處，另外BTV在哺乳動物細(xì)胞和媒介昆蟲細(xì)胞中復(fù)制機(jī)制的不同還有待闡明。BTV的分子生物學(xué)研究有助于闡明其致病機(jī)制和遺傳規(guī)律，對于藍(lán)舌病的防治具有重要意義，同時(shí)對闡明生物分子之間相互作用機(jī)制以及分子功能也有很大幫助。相信隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，這些問題將會得到很好的解決?！觯ň庉嫞黑w曉松）

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Characteristics and Utilization of Protein and Gene of Bluetongue Virus

Li Chenlong1,2,Wang Hongbin1,Song Xingang2,Sun Xin2
（1 Northeast Agricultural University Animal Medical College 150030；2 Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.Ltd,Harbin 150069）

Bluetongue virus is the cause of sheep,bovine bluetongue diseasepathogen.Bluetongue virus is a complex structure of the RNA virus,the research on the molecular biological characteristics,can clarify the pathogenesis and genetics law,have treatment to help blue tongue disease prevention study.The domestic research of bluetongue virus started late,this paper describes the disease virus gene structure and protein characteristics of blue tongue and to its use,in order to provide reference for the prevention and treatment.

bluetongue virus;gene protein;immune prevention

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.05.038

李辰龍，男，獸醫(yī)師，長期從事獸用生物制品質(zhì)量檢驗(yàn)與生產(chǎn)工作。

*通訊作者：王洪斌，男，教授博士生導(dǎo)師，研究方向：獸醫(yī)科學(xué)專業(yè)研究。