嚴(yán)雅靜，胡 飛，陳浩梁，蘇衛(wèi)華，魏兆軍*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽合肥 230031)

?

大黑鰓金龜消化與解毒相關(guān)基因的組織表達(dá)研究

嚴(yán)雅靜1，胡 飛1，陳浩梁2，蘇衛(wèi)華2，魏兆軍1*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽合肥 230031)

[目的]明確大黑鰓金龜幼蟲消化酶和解毒相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)情況，篩選中腸特異表達(dá)基因。[方法]利用RT-PCR方法對(duì)大黑鰓金龜幼蟲中腸消化酶(胰蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶)基因和解毒相關(guān)基因(細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、酯酶)在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。[結(jié)果]所調(diào)查的大黑鰓金龜?shù)?個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在中腸中都有表達(dá)，有3個(gè)基因在中腸中特異性表達(dá)。細(xì)胞色素P450家族中CYP6A20和CYP4C1 2個(gè)基因在中腸中特異表達(dá),3個(gè)氨肽酶基因(APN1、APN2和AP2)只在中腸中表達(dá)。[結(jié)論] 大部分大黑鰓金龜?shù)南负徒舛久富蛟谥心c中表達(dá)量最高。

大黑鰓金龜；中腸；基因；表達(dá)量

大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)，幼蟲俗稱蠐螬，對(duì)花生等農(nóng)作物以及林木幼苗和草坪危害嚴(yán)重，造成大面積減產(chǎn)[1]。到目前為止，關(guān)于大黑鰓金龜幼蟲蠐螬的研究主要集中在發(fā)生規(guī)律和常規(guī)防治方面，對(duì)中腸和生物防治靶標(biāo)分子生物學(xué)方面的研究很少[2]。由于大黑鰓金龜幼蟲生活在土壤中，土壤病原微生物在其取食植物根部的同時(shí)也一同侵入到消化道中，因此幼蟲的消化道環(huán)境很特殊[3]。中腸是消化道很重要的一部分，作為昆蟲的第二大器官[4]，具有分泌消化酶、消化食物和吸收營(yíng)養(yǎng)的功能；同時(shí)也是外源殺蟲劑或天然毒素新陳代謝的地方[5]，從而成為病原微生物、農(nóng)藥、各種毒素的作用靶標(biāo)。中腸消化涉及到很多酶，如絲氨酸蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等。絲氨酸蛋白酶廣泛分布在所有動(dòng)物和微生物中[6]。昆蟲中腸也是外源物新陳代謝的場(chǎng)所，解毒酶可以增強(qiáng)害蟲對(duì)農(nóng)藥的轉(zhuǎn)化和降解作用，從而使毒性降低，或者通過阻隔作用來(lái)保護(hù)自己的靶標(biāo)位點(diǎn)[7]。中腸中編碼解毒酶的高表達(dá)基因與殺蟲劑抗性有關(guān)，特別是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases，GSTs)、非專一性酯酶(ESTs)和細(xì)胞色素P450三大超基因家族[5]。

筆者在前期開展轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上，篩選了一些與中腸消化和解毒相關(guān)的基因，利用RT-PCR方法對(duì)這些基因在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，以期為尋找生物防治新靶標(biāo)以及研究抗藥性機(jī)理，進(jìn)一步開展大黑鰓金龜?shù)纳锓乐蔚於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料大黑鰓金龜飼養(yǎng)條件：溫度25～30 ℃，土壤含水量18%～20%。解剖大黑鰓金龜幼蟲的中腸、表皮、頭、脂肪體，整個(gè)操作在冰上進(jìn)行，將解剖的組織分別裝入1.5 ml離心管中，立即投入液氮冷凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大黑鰓金龜幼蟲組織總RNA的提取提取總RNA用到的器具(勻漿器、移液器槍頭、EP管等)要用DEPC水浸泡過夜，高溫高壓使DEPC水失活，置于烘箱中烘干備用，抽提RNA使用RNAiso Plus試劑盒，具體操作參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.3 cDNA的合成分別以表皮、頭、中腸、脂肪體中的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。cDNA合成反應(yīng)50 μl體系包括：PrimeScriptTMBuffer 10 μl，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 2.5 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)2.5 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)10 μl,RNA 4 μg，加RNase Free ddH2O到50 μl。于37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃ 5 s使酶失活。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)前期測(cè)定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)大黑鰓金龜幼蟲解毒酶和消化酶相關(guān)引物，引物序列見表1。引物設(shè)計(jì)后交上海生物工程公司合成。

1.5 RT-PCRPCR反應(yīng)體系25 μl：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μl，Primer 1(10 μmol/L) 1 μl，Primer 2(10 μmol/L)1 μl，模板 0.5 μl，Taq酶 0.2 μl，加ddH2O到 25 μl。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 GSTs基因在不同組織的表達(dá)6種GSTs基因在大黑鰓金龜幼蟲的中腸中都有表達(dá)，GST1-2、GST2和GSTsigma3種基因只在中腸特異表達(dá)。GSTOmega和GSTDelta2個(gè)基因在表皮、頭、中腸、脂肪體中都表達(dá)。同時(shí)GST1-1基因在表皮、中腸和脂肪體中表達(dá)，在頭中不表達(dá)(圖1)。昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在解毒代謝和殺蟲劑抗性中起重要作用，中腸是昆蟲解毒的重要器官，除中腸外，昆蟲脂肪體也是解毒和儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的器官[8]。昆蟲中GSTs在除中腸外的其他組織中表達(dá)，預(yù)示著這種酶可能參與昆蟲其他的生理過程，是為了適應(yīng)環(huán)境長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。

2.2 細(xì)胞色素P450基因在不同組織的表達(dá)所檢測(cè)的11個(gè)P450家族基因中，僅CYP4C和CYP6A20 2個(gè)基因在中腸特異表達(dá)；CYP6K1在中腸中不表達(dá)。CYP9E2、CYP6A8、CYP6A23、CYP6A17和CYP6A1在4個(gè)組織中都有表達(dá)，CYP9E2在中腸表達(dá)量較高，在其他組織表達(dá)量低，CYP6A23和CYP6A14基因片段在4個(gè)組織中表達(dá)量無(wú)明顯差異(圖2)。P450基因主要在中腸中高表達(dá)，其次在脂肪體中表達(dá)量也很高，只有少量 P450 基因在表皮和頭中有較高水平的表達(dá)，這預(yù)示著P450可能參與了大黑鰓金龜幼蟲解毒器官的解毒代謝。P450基因在表皮和頭中的表達(dá)，預(yù)示著這幾類P450可能還具有其他功能。

2.3 酯酶在不同組織的表達(dá)共檢測(cè)了7個(gè)酯酶相關(guān)基因包括3個(gè)羧酸酯酶基因(carboxylesterase-6，CarE-6-1，CarE-6-2，CarE-6-3)，2個(gè)酯酶esterase FE4(EstFE4-1，EstFE4-2)基因，1個(gè)酯酶esterase E4(EstE4)基因和1個(gè)酯酶esterase B1(EstB1)基因。EstFE4-1和EstFE4-2 2個(gè)基因只在中腸組織中特異表達(dá)，在表皮、頭和脂肪體中不表達(dá)。EstE4、CarE-6-2、CarE-6-3在4個(gè)組織中都有表達(dá)，EstE4和CarE-6-2基因片段在中腸中表達(dá)量最高(圖3)。酯酶是除P450和GSTs外的第3個(gè)重要的昆蟲解毒酶系，能夠降解多種殺蟲劑。羧酸酯酶是酯酶中重要的一類，也參與昆蟲的解毒過程[9]。該試驗(yàn)中EstFE4-1和EstFE4-2在中腸中特異性表達(dá)，中腸是昆蟲最重要的解毒器官之一，推測(cè)這2個(gè)基因與昆蟲解毒相關(guān)。

2.4 消化酶相關(guān)基因在不同組織的表達(dá)共檢測(cè)了7個(gè)消化酶相關(guān)基因在大黑鰓金龜幼蟲組織中的表達(dá)情況，分別為3個(gè)氨肽酶基因(APN1，APN2，AP2)，2個(gè)胰蛋白酶基因(TPS-1，TPS3A1)和2個(gè)羧肽酶基因(CPsB，ZincCPsA1)。APN1、APN2、AP2、TPS-1、CPsB這5個(gè)基因片段在中腸中特異性表達(dá)，在表皮、頭和脂肪體中都不表達(dá)(圖4)。其中羧肽酶ZincCPsA1基因在4個(gè)組織中都有表達(dá)，但在中腸中表達(dá)量最高。

3 結(jié)論與討論

該研究采用RT-PCR法對(duì)消化和解毒的功能基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)基因在不同組織部位表達(dá)量不同，不同基因在同一組織中的表達(dá)量也有差異，大部分基因在中腸中條帶最亮，說(shuō)明這些基因在中腸中表達(dá)量最高，其中一些基因在中腸中特異性高表達(dá)。該研究主要對(duì)中腸解毒和消化相關(guān)的基因進(jìn)行了表達(dá)分析，大部分解毒酶基因(如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因和P450基因)在中腸中高表達(dá)，其中一部分基因在脂肪體中表達(dá)量也很高，推測(cè)脂肪體和中腸是大黑鰓金龜?shù)闹饕舛酒鞴?；消化酶相關(guān)基因在中腸中表達(dá)量最高，這與中腸消化功能一致。

這些中腸中高表達(dá)的基因，需要今后采用更多的技術(shù)方法進(jìn)一步探索這些基因在大黑鰓金龜體內(nèi)的功能，對(duì)于昆蟲抗藥性的研究具有一定意義。

[1] 周洪旭，李長(zhǎng)友，李國(guó)勛.草坪害蟲華北大黑鰓金龜幼蟲圍食膜蛋白Ho-Peritrophin3基因克隆及序列分析[J].草葉學(xué)報(bào)，2010，19(6)：147-153.

[2] 劉小民，張霞，李杰，等.花生蠐螬中腸組織cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J].花生學(xué)報(bào)，2010，39(1)：15-19.

[3] ZHOU H X，TAN X M，LI C Y，et al.The Peritrophic matrix of two grubs，HolotrichiaoblitaandH.parallela(Coleoptera：Melolonthidae)and the effects ofHelicoverpaarmigera(Lepidoptera：Noctuidae)granulovirus enhancin on its structure[J].Entomological News，2009，120(5)：509-517.

[4] HAKIM R S，BALDWIN K，SMAGGHE G.Regulation of midgut growth，development，and metamorphosis[J].Ann Rev Entomol，2010，55：593-608.[5] SHEN G M，DOU W，HUANG Y，et al.In silico cloning and annotation of genes involved in the digestion，detoxification and RNA interference mechanism in the midgut ofBactroceradorsalis[Hendel(Diptera：Tephritidae)[J].Insect Molecular Biology，2013，22(4)：354-365.

[6] JOANITTI G A，F(xiàn)REITAS S M，SILVA L P.Proteinaceous protease inhibitors：Structural features and multiple functional faces[J].Curr Enzyme Inhibition，2006，2：199-217.

[7] 黃菁，喬傳令.昆蟲解毒酶解毒機(jī)理及其在農(nóng)藥污染治理中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，2002，21(3)：285-287.

[8] WU H H，ZHU K Y，GUO Y P，et al.Comparative studies of substrate and inhibitor specificity of glutathione S-transferase in six tissues ofOxyachinensis(Thunberg)(Orthoptera：Aerididae)[J].Agricultural Sciences in China，2008，7(4)：462-468.

[9] YAN S，CUI F，QIAO C.Structure，function and applications of carboxylesterases from insects for insecticide resistance[J].Protein Pept Lett，2009，16(10)：1181-1188.

Tissue Expression of the Genes Related to Detoxification Enzymes and Digestive Proteinases ofHolotrichiaoblita

YAN Ya-jing1, HU Fei1, CHEN Hao-liang2, WEI Zhao-jun1*et al (1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009; 2. Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, Anhui 230031)

[Objective] To clarify of the tissue expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases and identify the specific expressed genes in the midgut from the larvae ofHolotrichiaoblita. [Method] The expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases in epidermis, head, midgut and fat body genes were analyzd by RT-PCR. [Result] All the six GSTs genes were expressed in the midgut, and three of them were expressed in midgut specifically. As to the genes from the P450 family,CYP6A20 andCYP4C1 genes specifically expressed in midgut. Three aminopeptidase were specifically expressed in the midgut, includingAPN1,APN2 andAP2. [Conclusion] The expression of most of the genes related to the digestive proteinases and detoxification enzymes in midgut are higher than in other tissues.

Holotrichiaoblita; Midgut; Genes; Expression

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“農(nóng)田地下害蟲綜合防控技術(shù)研究與示范”(201003025)。

嚴(yán)雅靜(1987-)，女，安徽固鎮(zhèn)人，碩士研究生，研究方向：昆蟲與植物互作。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事昆蟲分子生物學(xué)研究。

2015-04-14

S 188

A

0517-6611(2015)16-057-03