王曉婧, 陸 偉, 徐玉泉*, 梁曉東

1.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081 2.國藥一心制藥有限公司, 北京 100176

由聚酮合酶(poylketide synthases, PKS)生物合成的真菌聚酮是一類化學結構多樣、生物活性廣泛的天然產(chǎn)物家族，具有重要的經(jīng)濟價值和藥用價值[1,2]。其中包括二羥基苯甲酸內(nèi)酯(resorcylic acid lactones, RALs)和二羥基苯乙酸內(nèi)酯(dihydroxyphenylacetic acid lactones, DALs)在內(nèi)的苯二酚內(nèi)酯(benzenediol lactones, BDLs)類化合物更是呈現(xiàn)出抗癌、抑制熱休克反應和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等重要藥用活性，對于這類化合物生物合成的研究是當今該領域的熱點之一[3]。本文綜述了苯二酚內(nèi)酯的雙聚酮合酶協(xié)作合成機制和組合生物合成，以期為更深入的研究真菌苯二酚內(nèi)酯的作用機理提供參考。

1 真菌聚酮合酶

聚酮合酶在結構上與脂肪酸合成酶類似，它們可能擁有共同的進化起源[4]。聚酮合酶基因大多定位在染色體接近端粒的部位[5]，與聚酮合酶后修飾過程的編碼基因、調(diào)節(jié)基因及抗性基因等成簇存在[6]。聚酮合酶根據(jù)其結構和催化機制不同可分為3類：模塊化Ⅰ型PKS(modular PKS Ⅰ)、迭代Ⅱ型PKS(iterative PKS Ⅱ)和查爾酮Ⅲ型PKS(chalcone PKS Ⅲ)。真菌PKS從結構角度看屬于模塊化Ⅰ型PKS，但是之后發(fā)現(xiàn)這些模塊在聚酮鏈的裝配過程中大多是重復使用的，因此將它單獨分為一類，即重復的Ⅰ型PKS (iterative PKS Ⅰ, iPKS Ⅰ)。根據(jù)在催化過程中對酮基還原程度的不同，真菌聚酮合酶又可分為非還原型PKS(non-reduced, nr PKS)和還原型PKS(highly reduced, hr PKS)[7～9]。

真菌聚酮合酶是由不同的功能結構域組成固定化的模塊[9]，其中識別起始單元或者延伸單元的酰基轉移酶(acyl transferase, AT)、催化雙碳單位縮合反應的酮酯?；厦?ketosynthase, KS)、結合延長聚酮鏈的?；D運蛋白(acyl carrier protein, ACP)是PKS的核心結構單元。hr PKS包含酮還原酶(ketoacyl reductase，KR)、脫水酶(dehydratase, DH)、烯基還原酶(enoy lreductase, ER)等結構域?qū)铣傻耐鲞M一步的還原。nr PKS含有起始單元?；D移酶(starter unit ACP acyltransferase, SAT)、產(chǎn)物模板結構域(product template, PT)、硫脂酶(thioesterase, TE)，分別負責接受上游起始合成產(chǎn)物、合成產(chǎn)物的折疊和釋放[9,10]。

2 苯二酚內(nèi)酯的雙酶協(xié)作生物合成機制

大多數(shù)真菌聚酮只需要一個PKS催化合成，而合成苯二酚內(nèi)酯需要一對高度還原型hr PKS和非還原型nr PKS的共同催化，這種合成機制被稱為雙酶協(xié)作機制[11～13]。首先，由hr PKS生成一條線性還原聚酮鏈，并通過SAT直接傳遞給nr PKS繼續(xù)延伸聚酮，通過羥醛縮合反應，PT催化第一個芳香環(huán)形成，通過Claisen酯縮合反應，TE催化形成第二個內(nèi)酯環(huán)，并從聚酮合酶上釋放產(chǎn)物[1]。在苯二酚內(nèi)酯生物合成過程中，需要hr PKS和nr PKS之間，PKS內(nèi)部結構域之間相互識別和協(xié)作，程序化地完成從起始底物的識別、聚酮鏈還原程度和長度的確定、芳香環(huán)的折疊模式、產(chǎn)物的釋放等生物合成過程(圖1)。

圖1 苯二酚內(nèi)酯化合物生物合成Fig.1 Biosynthesis of benzenediol loctone.注：實箭頭為必需步驟，虛箭頭為非必需步驟

生物合成苯二酚內(nèi)酯類化合物的聚酮合酶，在結構域的組合方式和氨基酸序列上都有很高的一致性，如hr PKS都含有KS、AT、KR、ER、DH和ACP結構域，nr PKS都含有SAT、KS、AT、PT、ACP和TE結構域[14,15]；合成苯二酚內(nèi)酯radicicol、hypothemycin、zearalenone以及curvularin聚酮合酶之間氨基酸序列的一致性分別可達到55%～61%(hr PKS)和49%～54%(nr PKS)[15]。另外，在基因組中，苯二酚內(nèi)酯聚酮合酶hr PKS和nr PKS的編碼基因一般都相鄰成對出現(xiàn)[14]?；谏鲜霰蕉觾?nèi)酯PKS的結構和編碼基因的顯著特點，利用SMURF(Secondary Metabolite Unknown Regions Finder)和antiSMASH(antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell)等工具能夠從已測序的基因組中挖掘到更多苯二酚內(nèi)酯類化合物的生物合成途經(jīng)[16,17]。但是，由于苯二酚內(nèi)酯程序化生物合成的精確機制不清楚，如確定聚酮鏈的長度、酮基的還原程度、中間產(chǎn)物的立體構型等合成機制，僅僅通過基因序列的信息無法預測出絕大部分化合物的結構[17]。另一方面，由于很多真菌產(chǎn)生的苯二酚內(nèi)酯類化合物數(shù)量很少，或者只在特殊的環(huán)境下才能合成，所以，在實驗室條件下，大部分苯二酚內(nèi)酯合成基因的功能未知[24,25]。迄今為止，研究重點依然在已知結構苯二酚內(nèi)酯的生物合成上(表1，圖2)。

表1 真菌苯二酚內(nèi)酯類化合物Table 1 Fungal benzenediol lactones.

圖2 苯二酚內(nèi)酯聚酮類化合物及其類似物結構Fig.2 Structures of BDLs and its analogs.

3 典型苯二酚內(nèi)酯類化合物的生物合成

3.1 Radicicol的生物合成

Radicicol(圖2-5)是一種二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物，能夠通過抑制Hsp90熱休克蛋白調(diào)節(jié)熱激反應阻斷多條致癌通路[12,14,18]。多種真菌都可產(chǎn)生Radicicol，其中Chaetomiumchiversii[14]和Pochoniachlamydosporia[13]中的生物合成途徑已經(jīng)得到闡明。

在Chaetomiumchiversii生物合成radicical的過程中，還原型聚酮合酶CcRadS1和非還原型聚酮合酶CcRadS2協(xié)同作用合成radicical核心骨架monocillin Ⅱ(圖2-1)，二者缺一不可[14](圖3)。基因敲除上述任何一個聚酮合酶的編碼基因，都不能獲得預期的產(chǎn)物。通過在酵母表達系統(tǒng)中異源共表達CcRadS1和CcRadS2基因，可以在發(fā)酵液中檢測到monocillin Ⅱ[14]。另外，將在酵母中表達的合成radicicol的還原型聚酮合酶Rdc5和非還原型聚酮合酶Rdc1純化后，加入丙二酰CoA和輔因子NADPH，同樣可以合成中間產(chǎn)物monocillin Ⅱ[13]。以上基因敲除和體內(nèi)體外重構活性酶蛋白的實驗，都驗證了還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶在radicical生物合成途徑中的重要性。

圖3 Radicicol的生物合成Fig.3 Biosynthesis pathway of radicicol.

在radicicol的合成基因簇中，含有鹵化酶基因，其蛋白序列與細菌中黃素依賴鹵化酶一致性很高。敲除鹵化酶RadH基因后，得到一個缺少氯原子的radicical類似物monocillin I (圖2-2)[14]。在酵母表達系統(tǒng)中異源共表達鹵化酶Rdc2、Rdc5和Rdc1的編碼基因，可以在發(fā)酵液中檢測到增加一個氯原子的monocillin Ⅱ類似物pachonin D(圖2-3)[13]，該物質(zhì)曾在P.chlamydosporia中分離鑒定出來[26]。在離體實驗中，只有加入FAD時，在Rdc2的催化下，monocillin Ⅱ的C6或C4、C6上添加氯原子形成pachonin D(圖2-3)或化合物(圖2-4)，以上實驗均驗證了黃素依賴鹵化酶的功能。

此外，敲除細胞色素氧化酶P450基因RadP得到一個缺少環(huán)氧環(huán)的radicical類似物pachonin D，說明RadP表達產(chǎn)物具有環(huán)氧酶功能。敲除預測的RadR轉錄因子基因，不能合成radicicol，表明RadR在radicicol合成過程中起正調(diào)控作用[12]。

以上的研究證明在radicicol的生物合成中，通過還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶協(xié)同催化合成核心骨架monocillin Ⅱ，然后經(jīng)過核黃素依賴的鹵化酶、細胞色素氧化酶的修飾，monocillin Ⅱ分別在C6、C14-C15處增加一個氯原子和一個環(huán)氧原子形成radicical。在生物合成過程中，轉錄因子對激活合成途徑也起到了重要的作用[14]?？傊?，只有在生物合成radicicol的多個酶的協(xié)調(diào)作用下，才能生成完整的化合物。

3.2 Hypothemycin 的生物合成

在Hypomycessubiculosus和其他一些真菌中生物合成的hypothemycin(圖2-8)是一種MAP激酶抑制劑[18,27,28]，其核心骨架DHZ(圖2-6)是由還原型聚酮合酶Hpm8和非還原型聚酮合酶Hpm3協(xié)同合成。通過在酵母表達系統(tǒng)中異源共表達Hpm8和Hpm3，可以在發(fā)酵液中檢測到DHZ[13]；Hpm8單獨表達時，只能在發(fā)酵液中檢測到吡喃酮類化合物，而不是預期的六酮；Hpm3單獨表達時，可以接受天然前體類似物生物合成DHZ，但是不能直接利用丙二酰CoA作為底物[19]，這說明在Hypothemycin的生物合成中非還原型聚酮合酶只接受還原型聚酮合酶合成中間產(chǎn)物。通過SAT結構域突變，證明非還原型聚酮合酶上的SAT結構域是連接兩個聚酮合酶的重要環(huán)節(jié)[13]，另外，還原型聚酮合酶合成中間產(chǎn)物的速率決定DHZ的生成速率[13]。以上研究說明hypothemycin的生物合成需要還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶協(xié)同完成。

苯二酚內(nèi)酯的生物合成中，氧甲基轉移酶(O-methyltransferase, OMT)能夠?qū)⒈江h(huán)上的羥基轉化為氧甲基。在離體實驗中，H.subiculosus中的氧甲基轉移酶基因Hpm5可以將C5的羥基甲基化[18]。黃素依賴的單加氧酶(flavin-dependent monooxygenase, FMO)Hpm7能夠在DHZ的C8-C9之間形成環(huán)氧鍵，在NADPH存在時，Hpm7可以將zearalenone(圖2-10)或desepoxyhy-pothemycin的C-C雙鍵轉化成環(huán)氧鍵。在hypothemycin的生物合成基因簇中，還包含乙醇氧化酶基因和谷胱甘肽-S-轉移酶基因，這些基因的確切功能還不清楚[18]。

3.3 Zearalenone 的生物合成

真菌生物合成的zearalenone(圖2-10)是一種雌激素抑制劑[20]。在玉蜀黍赤霉Gibberellazeae中，還原型聚酮合酶ZEA2和非還原型聚酮合酶ZEA1協(xié)同作用合成核心骨架zearalenol?；蚯贸魏我粋€聚酮合酶的編碼基因，都不能合成zearalenol(圖2-9)[21]。ZEA1在大腸桿菌中表達純化后，加入天然前體類似物六烯酮后，可以合成預期的化合物[22]。實驗中還證明了ZEA1合成途徑可以和脂肪酸生物合成途徑相互作用，不加入天然前體類似物六烯酮時，大腸桿菌仍能產(chǎn)生少量?；u基苯甲酸化合物，這些化合物是以大腸桿菌脂肪生物合成途徑中的短鏈脂肪?；蝓プ鳛槠鹗紗卧铣傻腫22]。

在zearalenone的生物合成中，通過還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶協(xié)同催化合成核心骨架zearalenol[21]，之后經(jīng)過乙醇氧化酶的修飾，zearalenol生成zearalenone，完成整個化合物的生物合成過程。

3.4 Curvularin的生物合成

Curvularin是一種具有Hsp90抑制活性和免疫調(diào)節(jié)活性的苯二酚內(nèi)酯類化合物，能夠在Alternaria、Aspergillus、Cochliobolus、Curvularia和Penicillium等真菌中合成[15]。上述介紹的苯二酚內(nèi)酯屬于二羥基苯甲酸內(nèi)酯，而curvularin是二羥基苯乙酸內(nèi)酯，二者在芳香環(huán)的折疊環(huán)化方式上有差異[1]。

Curvularin的生物合成同樣需要還原型聚酮合酶和非還原型聚酮合酶雙酶協(xié)作合成核心骨架。通過在酵母表達系統(tǒng)中異源共表達還原型聚酮合酶AtCURS1基因和非還原型聚酮合酶AtCURS2基因，可以在發(fā)酵液中檢測到10,11-Dehydrocurvularin(圖2-11)[15]。AtCURS2單獨在酵母中表達時，其SAT結構域可以接受天然前體類似物四烯酮，但是當添加的四烯酮增加為五烯酮時，就不能生成預期的化合物，這說明AtCURS2的SAT結構域在前體長度的選擇上有局限性[15]。

苯二酚內(nèi)酯類化合物的芳香環(huán)是通過PT結構域的羥醛縮合反應環(huán)化而來的，其PT結構域與細菌芳香化酶/環(huán)化酶在氨基酸序列上相似性很低，蛋白折疊模式和活性位點也完全不同，這是一個很典型的趨同進化的例子。真菌苯二酚內(nèi)酯類化合物通常遵循F-型折疊模式，合成C2-C7、C4-C9或C6-C11型產(chǎn)物，如radicicol等[1]；curvularin的合成遵循與細菌類似的S-型折疊模式，在C3-C8處羥醛縮合生成curvularin。盡管折疊模式不同，F(xiàn)-型radicicol和S-型curvularin的PT結構域在活性位點和環(huán)化室上有很高的保守性(47%序列一致性和65%相似性)。生物信息學確認PT結構域活性中心上的3個重要氨基酸位點，即curvularin:W1584、F1455和Y1576；radicicol:L1609、Y1478和F1601，氨基酸替換實驗表明，curvularin PT中兩個氨基酸位點被替換時，能夠產(chǎn)生F-型化合物，當3個氨基酸位點都被取代時，S-型化合物完全消失，而只產(chǎn)生F-型化合物。這說明苯二酚內(nèi)酯非聚酮合酶PT結構域中關鍵氨基酸的改變可影響第一個芳香環(huán)的環(huán)化模式[1]。

4 展望

苯二酚內(nèi)酯雙聚酮合酶協(xié)同合成的催化機制和聚酮合酶模塊化的結構，為組合不同真菌來源的合成模塊和模塊內(nèi)的結構域組合生物合成“非天然”的苯二酚內(nèi)酯類化合物奠定基礎[28]。組合生物合成技術是近年興起的，通過擴展天然產(chǎn)物結構的多樣性，形成新生物合成途徑，從而產(chǎn)生非天然化合物的新方法。利用該技術合成苯二酚內(nèi)酯類化合物是當前藥物研發(fā)的熱點，但尚處于起步階段。通過聚酮合酶亞基重排和隨機組合，能夠在釀酒酵母中異源表達新型聚酮合酶，實現(xiàn)一系列“非天然的”的聚酮類化合物的一步合成，為新一代藥物篩選提供新的候選化合物庫，同時為揭示天然聚酮類化合物的程序化合成機制奠定了重要的理論基礎。這種“即插即用”的模塊化方法可應用于結構多樣的全新化學物質(zhì)的組合生物合成中。利用合成生物學的方法，在現(xiàn)有合成模塊的基礎上，通過人工設計和智能優(yōu)化，創(chuàng)造更多新型重要活性的苯二酚內(nèi)酯聚酮化合物，是未來真菌聚酮合成生物學的發(fā)展方向[28～31]。

[1] Xu Y Q, Zhou T, Zhou Z F,etal.. Rational reprogramming of fungal polyketide first-ring cyclization[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, 110(14): 5398-5403.

[2] Chiang Y M, Oakley C E, Hhuja M,etal.. An efficient system for heterologous expression of secondary metabolite genes inAspergillusnidulans[J]. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135: 7720-7731.

[3] Xu Y Q, Zhou T, Zhang S W,etal.. Thioesterase domains of fungal nonreducing polyketide synthases act as decision gates during combinatorial biosynthesis[J]. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135: 10783-10791.

[4] 周禮紅. 紅曲霉遺傳轉化系統(tǒng)及桔霉素、MonaocnilK生物合成相關PKS基因的克隆與功能鑒定[D]. 江蘇 無錫：江南大學, 博士學位論文,2005.

[5] Keller N P, Turner G，Bennett J W,etal.. Fungal secondary metabolism-from biochemistry to genomics[J]. Nat. Rev. Microbiol., 2005, 3(12): 937-947.

[6] 魏康霞. 橙色紅曲菌聚酮合酶基因的克隆[D].南昌：南昌大學，碩士學位論文,2007.

[7] 嚴少華, 郭 亮. 真菌聚酮合酶分類進展及其應用[J]. 江西科學, 2006, 24(2): 170-172.

[8] 陳路劼, 趙 薇, 連云陽. 聚酮合酶與藥物篩選的研究進展[J]. 中國抗生素雜志, 2012, 37(9): 655-661.

[9] Chiang Y M, Oakley B R, Keller N P,etal.. Unraveling polyketide synthesis in members of the genusAspergillus[J]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 86(6): 1719-1736.

[10] Adrian T, Keatinge C. The structures of type I polyketide synthases[J]. Nat. Prod. Rep., 2012, 29: 1050-1073.

[11] Winter J M, Sato M,Sugimoto S,etal.. Identification and characterization of the Chaetoviridin and Chaetomugilin gene cluster inChaetomiumglobosumreveal dual functions of an iterative highly-reducing polyketide synthase[J].J. Am. Chem. Soc.,2012,134(43): 17900-17903.

[12] Zhou H, Qiao K J, Gao Z Z,etal.. Insights into radicicol biosynthesis via heterologous synthesis of intermediates and analogs[J]. J. Biol. Chem., 2010, 285(53): 41412-41421.

[13] Zhou H, Qiao K J, Gao Z Z,etal.. Enzymatic synthesis of resorcylic acid lactones by cooperation of fungal iterative polyketide synthases involved in Hypothemycin biosynthesis[J]. J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(13): 4530-4531.

[14] Wang S H, Xu Y Q, Maine E A,etal.. Functional characterization of the biosynthesis of radicicol, an Hsp90 inhibitor resorcylic acid lactone fromChaetomiumchiversii[J]. Chem. Biol., 2008, 15: 1328-1338.

[15] Xu Y Q, Artiles P E, Schubert V,etal.. Characterization of the biosynthetic genes for 10,11-Dehydrocurvularin, a heat shock response-modulating anticancer fungal polyketide fromAspergillusterreus[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2013,79(6): 2038-2047.

[16] 王 芬. 變構菌素生物合成相關基因功能的研究[D]. 遼寧 大連：大連理工大學, 博士學位論文,2013.

[17] Chiang Y M, Lee K, Sancheza J F,etal.. Unlocking fungal cryptic natural products[J]. Nat. Prod. Commun., 2009, 4(11): 1505-1510.

[18] Reeves C D, Hu Z H, Reid R,etal.. Genes for the biosynthesis of the fungal polyketides hypothemycin fromHypomycessubiculosusand radicicol fromPochoniachlamydosporia[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2008, 74(16): 5121-5129.

[19] Gao Z Z, Wang J J, Norquay A K,etal.. Investigation of fungal iterative polyketide synthase functions using partially assembled intermediates[J]. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135(5): 1735-1738.

[20] Kim Y T, Lee Y R, Jin J M,etal.. Two different polyketide synthase genes are required for synthesis of zearalenone inGibberellazeae[J]. Mol. Microbiol., 2005, 58(4): 1102-1113.

[21] Gaffoor I, Trail F. Characterization of two polyketide synthase genes involved in zearalenone biosynthesis inGibberellazeae[J]. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 5: 1793-1799.

[22] Zhou H, Zhan J X, Watanabe K J,etal.. A polyketide macrolactone synthase from the filamentous fungusGibberellazeae[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105(17): 6249-6254.

[23] Xu Y Q, Zhou T, Espinosa A P,etal.. Insights into the biosynthesis of 12-membered resorcylic acid lactones from heterologous production inSaccharomycescerevisiae[J]. ACS Chem. Biol., 2014,9(5): 1119-1127.

[24] Sanchez J F, Somoza A D, Keller N P,etal.. Advances inAspergillussecondary metabolite research in the post-genomic era[J]. Nat. Prod. Rep., 2012, 29: 351-371.

[25] Wiemann P, Keller N P. Strategies for mining fungal natural products[J]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2014,41: 301-313.

[26] Moulin E, Zoete V, Barluenga S,etal.. Design, synthesis, and biological evaluation of HSP90 inhibitors based on conformational analysis of radicicol and its analogues[J]. J. Am. Chem. Soc., 2005, 127: 6999-7004.

[27] El E T, Figueroa M, Raja H A,etal.. Biosynthetically distinct cytotoxic polyketides fromSetophomaterrestris[J]. Eur. J. Org. Chem.,2015,1: 109-121.

[28] Schirmer A, Kennedy J, Sumati M,etal.. Targeted covalent inactivation of protein kinases by resorcylic acid lactone polyketides[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103: 114234-114239.

[29] Xu Y Q, Zhou T, Zhang S W,etal.. Diversity-oriented combinatorial biosynthesis of benzenediol lactone scaffolds by subunit shuffling of fungal polyketide synthases[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2014, 111(34): 12354-12359.

[30] 黃惠娟, 喬建軍. 聚酮類抗生素組合生物合成[J]. 細胞生物學雜志，2007, 29：692-696.

[31] 張曉琳. 阿維鏈霉菌中聚酮合酶基因的遺傳改造[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學, 博士學位論文,2004.