吳 森, 張鶯鶯, 昝林森,2*

1.西北農林科技大學動物科技學院, 陜西 楊凌 712100;2.西北農林科技大學國家肉牛改良中心, 陜西 楊凌 712100

植物是自然界中普遍存在的重要可再生資源，且存量巨大，但大多數(shù)是人類不能直接利用的。草食性動物及雜食性動物具有其他動物所沒有的能力——消化植物纖維，將植物纖維轉化為肉、蛋、奶等產品供人類利用。這種轉化作用主要為草食性動物胃及腸道寄生微生物對植物細胞壁中復雜碳水化合物的降解作用，包括對木聚糖、果膠、纖維素等的降解作用。揭示動物胃腸道中主要微生物的作用機理，對人工干預和提高植物源性資源向動物產品轉化的效率，促進動物科學精準飼養(yǎng)，以及植物源性材料的人工發(fā)酵等具有重要意義。

隨著技術的發(fā)展，基于高通量測序技術的宏基因組技術，通過提取特定環(huán)境中的微生物總DNA、構建文庫，可以獲得大量微生物群落種類、豐度及相關生物學信息。相對于傳統(tǒng)微生物研究方法的分離、培養(yǎng)，更能獲得大量的不可培養(yǎng)的微生物信息，是目前研究特定環(huán)境微生物的重要技術手段。本文綜述了常見Roche 454、Illumina基因分析和ABI SOLiD測序三大高通量測序平臺的宏基因組技術在動物胃腸道微生物的研究應用進展，旨在為動物科學生產及微生物發(fā)酵等相關領域的研究工作提供科學指導。

1 基于高通量測序的宏基因學技術在反芻動物胃部微生物方面的應用研究

大多數(shù)哺乳動物缺乏消化植物細胞壁(纖維素、半纖維素、果膠、β-葡聚糖、低聚糖和木質素等)的酶，而反芻動物等草食動物可通過瘤胃降解消化植物，利用在瘤胃中微生物的厭氧發(fā)酵產生的短鏈脂肪酸，以獲得所需的大部分營養(yǎng)，約是動物所需營養(yǎng)的60%～80%，其余20%左右的能量在大腸部位消化吸收[1]。由于胃腸道微生物種類繁多、豐度不一、作用多樣，常規(guī)分離提取培養(yǎng)等方法難以全面了解這些微生物發(fā)酵的分子機理。隨著現(xiàn)代DNA、RNA測序技術和生物學信息分析技術的發(fā)展，現(xiàn)代宏基因組學為人們研究反芻動物胃腸道微生物群落結構功能提供了新的思路與方法。

1.1 甲烷排放相關研究

牛、羊等反芻動物的瘤胃是一個巨大的微生物資源庫，擁有豐富的菌種。主要有細菌、古菌、原蟲和真菌，是迄今為止已知的分解纖維物質能力最強的天然發(fā)酵罐，可在厭氧條件下將纖維、果膠、淀粉和蛋白質等降解為短鏈脂肪酸等營養(yǎng)物質供機體吸收。瘤胃中的真菌對發(fā)酵作用影響顯著，相對于纖維素，其能更有效地降解木質素[2]。反芻動物瘤胃中含量較少的古菌主要是甲烷菌屬，且甲烷產量可以作為衡量瘤胃對日糧利用效率的重要指標[3]。但是，甲烷氣體是引起溫室效應的主要因素之一，畜牧業(yè)中的甲烷排放對引起全球變暖的溫室效應有著不可推卸的責任。畜牧生產中甲烷氣體主要是植物在反芻動物瘤胃的厭氧環(huán)境下由甲烷菌屬的相關產甲烷菌發(fā)酵后產生的[4]。由于產甲烷菌群落組成復雜，難以完全鑒定，特別是在動物體內環(huán)境中[5]。傳統(tǒng)檢測反芻動物胃腸的甲烷菌是通過針對已知的甲基輔酶M還原酶a亞基(methyl coenzyme-M reductase A，mcrA)或SSU(small-subunit)rRNA數(shù)據(jù)庫設計引物，qPCR擴增檢測特定類群微生物數(shù)量；或者用一些化學標記物檢測產甲烷菌代謝附屬物，來分析產甲烷古菌的代謝情況[6]。但因為數(shù)據(jù)庫更新慢、引物特異性低和代謝附屬物易受體內其他條件影響等因素，造成檢測精度低、獲得的信息量少。例如，Tymensen[7]用5種常用SSU rRNA引物擴增檢測黑安格斯牛瘤胃液中的古菌，結果之間有一些偏差。但高通量測序技術以其高輸出量和高解析度的優(yōu)點，可更加全面的檢測反芻動物瘤胃復雜微生物環(huán)境中古菌的生物學信息。Snelling等[8]運用傳統(tǒng)Sanger 16S rRNA基因擴增及Illumina平臺高通量16S rRNA基因測序，分析了蘇格蘭高地綿羊瘤胃中產甲烷的甲烷短桿菌、甲烷桿菌及甲烷球菌，對比測序結果分析后發(fā)現(xiàn)Illumina平臺高通量的V6-V8 16S rRNA基因測序能更高效用于檢測瘤胃古菌群落的研究。

1.2 植物降解相關研究

瘤胃對植物的降解作用，主要是瘤胃中原蟲、真菌及細菌微生物發(fā)酵產生可降解植物的相關酶類。傳統(tǒng)研究反芻動物瘤胃微生物對植物降解作用的方法，需要對瘤胃內容物提取、分離后培養(yǎng)鑒定，方法繁瑣，獲得數(shù)據(jù)量少，且有大量不可培養(yǎng)的微生物流失。運用高通量測序的宏基因組技術可獲得大量與植物降解相關的微生物信息。例如，Singh等[9]對印度水牛瘤胃中的微生物做高通量測序后，獲得137 270個contigs(contiguous sequences)。鑒定后有2 614個具有編碼降解酶功能的contigs，包括聚糖水解酶類(glycoside hydrolases，GH: 1943 contigs)、糖結合模塊(carbohydrate binding module，CBM: 23 contigs)、糖基轉移酶(glycosyl transferase，GT: 373 contigs)、糖類酯酶(carbohydrate esterases，CE: 259 contigs)及多聚糖裂解酶類(polysaccharide lyases，PE: 16 contigs)；Rosewarne等[10]對飼喂無芒虎尾草的印度閹牛采用瘤胃瘺管法采集瘤胃食糜后，以Roche 454平臺16S rRNA基因高通量測序，對瘤胃微生物生物信息分析發(fā)現(xiàn)，有50多個顯著的多聚糖利用作用位點(sus-like polysaccharide utilization loci，PULs)，且這些位點在草食動物中廣泛存在，主要起降解植物的作用；Wang等[11]通過高通量測序對瘤胃木質纖維素降解相關細菌檢測后，鑒定出了大量木質纖維素特異降解性細菌；Sarubbi等[12]采用基于高通量測序的宏基因組技術分析了奶牛瘤胃微生物對高粱、玉米青貯的降解作用，對關鍵性纖維素分解微生物及木聚糖分解相關微生物的豐度、組成測序后，關聯(lián)日增重與產奶量后發(fā)現(xiàn)瘤胃對兩者的降解能力相同，無顯著差異，從而得知高粱、玉米青貯可互替代。應用高通量測序的宏基因組技術能夠方便的獲得大量植物降解相關微生物的生物學信息，為動物營養(yǎng)學等提供參考。

1.3 與抗病致病基因篩選相關的研究

動物體內微生物與動物健康、人類食品安全密切相關。盡管大部分牛瘤胃腸道微生物都已經(jīng)鑒定出來，但是少有整個群落基因的功能性研究，特別是關于抗病、致病性微生物的研究?；诟咄繙y序技術的宏基因組學研究，在單方面獲得微生物多樣性信息的同時，可以從整個微生物環(huán)境的層面來獲得與抗病、致病相關的微生物信息。如2012年，Singh等[13]對印度水牛瘤胃內容物進行了高通量宏基因組測序分析，在獲得瘤胃微生物多樣性信息的同時，研究其抗菌素耐藥性及細菌毒力時發(fā)現(xiàn)，測序結果中有6.44%的基因序列為病毒相關基因，與抗生素抵抗和毒素生成有關，且這一數(shù)據(jù)高于肉雞盲腸微生物的5.39%和奶牛瘤胃微生物的4.43%；為研究瘤胃微生物與細菌及抗菌素抗性之間的關系，Reddy等[14]對飼喂青、干粗飼料的印度水牛瘤胃液及食糜中的微生物應用高通量測序宏基因組技術，發(fā)現(xiàn)在門水平，所有組中擬桿菌門和厚壁菌門分別占各組微生物的第一和第二，且瘤胃液、固體食糜中，關于氧化性應激應答和抗病性功能基因序列基本相同，但抗氟喹諾酮、多耐藥性外排泵(multiple drug resistance(MDR) efflux pumps)和抗甲氧西林相關基因的表達卻交叉分布于11、9、14種細菌中。另外，細菌與噬菌體應答、包裝及噬菌體原體有關，鏈球菌噬菌體與擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門細菌分布有關。高通量測序的宏基因組技術不僅可以對反芻動物瘤胃微生物做出基礎的菌群群落分析，也可相對定量的做出定性分析。

1.4 日糧組成對反芻動物瘤胃微生物的影響

瘤胃微生物穩(wěn)態(tài)受多方面的影響，其中不同日糧組成對瘤胃微生物影響顯著。在日糧組成對反芻動物瘤胃微生物影響的相關研究方面，采用基于高通量測序的宏基因組技術，對不同日糧處理的反芻動物瘤胃樣檢測后，可獲得遠多于傳統(tǒng)方法的大量微生物的生物學信息，便于更準確的分析日糧與瘤胃微生物的關系。如Pitta等[15]用不同精粗比例的飼料飼喂印度水牛6周后，采集瘤胃食糜、瘤胃液后進行高通量測序共獲得333 851 pyrotags。做系統(tǒng)進化分析(phylogenetic analysis)后顯示，不同比例粗飼料日糧(50%、75%、100%粗飼料)可引起瘤胃微生物的顯著性差異；不同日糧成分可引起微生物群落組成的不同。在屬水平，日糧的變化會引起微生物群落組成的顯著差異：在100%粗飼料組中，瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和纖維桿菌屬(Cellulomonas)含量與其他兩組相比顯著增高；在50%粗飼料組中普氏菌屬(Prevotella)含量顯著高于其他組。Patel等[16]以不同青草、干草粗飼料與不同精飼料比例的日糧飼喂水牛，提取瘤胃樣本進行高通量宏基因組測序，分析碳水化合物激活酶(carbohydrate active enzymes，CAZymes)，共獲得2 597個被CAZyme analysis toolkit (CAT)識別的CAT重疊區(qū)(contigs encoding)；飼喂青草粗飼料的水牛瘤胃中多糖降解細菌屬(如纖維桿菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬、放線菌屬和瘤胃球菌屬細菌)豐度顯著高于飼喂干草粗飼料組，且果膠消化酶類(如果膠裂合酶1、膠裂合酶10及多糖降解酶28)顯著高于飼喂干草粗飼料組。相似的，Parmar等[17]對8頭以青草、干草為粗飼料的水牛瘤胃微生物做高通量宏基因組測序分析后發(fā)現(xiàn)，兩種粗飼料處理水牛瘤胃微生物均是：在門水平上，擬桿菌占主要地位；在屬水平上，普氏菌屬占最多數(shù)。相對于瘤胃液，固體食糜中厚壁菌門與擬桿菌門微生物比率較高。以干草為粗飼料的牛瘤胃固體食糜中，擬桿菌門數(shù)量隨著粗飼料的增加顯著升高。且在屬水平，隨著粗飼料比例的增加，梭菌(Clostridium)含量顯著增加。另外，對飼喂青草、干草組的瘤胃液中糖苷水解酶類及碳水化合物激活酶類(cellulosome functional)基因表達量檢測發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中纖維素含量的增加，糖苷水解酶3(GH3)水平升高。Roggenbuck等[18]對飼喂多葉苜蓿和非洲當?shù)責釒敛莸拈L頸鹿瘤胃液及固體內容物進行16S rRNA基因擴增及Roche 454平臺高通量測序后發(fā)現(xiàn)，瘤胃液與內容物微生物之間沒有顯著差異；不同飼草飼喂的長頸鹿瘤胃微生物中厚壁菌門及擬桿菌門細菌均表現(xiàn)出較高豐度，其中普氏菌屬和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)豐度最高；而且在測序結果中約20%的細菌序列為首次發(fā)現(xiàn)的細菌序列。這些均是調整日糧后，應用高通量測序技術所得到的豐富詳細的宏基因組學信息，極大的方便了學者對日糧與動物胃部微生物關系的把握。

1.5 牛不同發(fā)育階段瘤胃微生物的變化研究

反芻動物瘤胃微生物對機體的生理活動非常重要。但是，在以牛為典型代表的反芻動物的生長過程中，微生物群落的種類、豐度如何變化呢？Jami等[19]選取了從出生1 d到2歲的成年以色列荷斯坦奶牛，研究宿主年齡變化對瘤胃微生物群落的影響。其中，6月齡和2歲齡采用70%精料+30%粗飼料飼喂，2月齡斷奶牛飼喂母乳和特定的固體補充精料，初生犢牛6頭僅飼喂初乳。結果發(fā)現(xiàn)，瘤胃發(fā)酵整個過程是一個從有氧發(fā)酵到無氧發(fā)酵的過程，微生物群落逐漸豐富活躍。其中初生犢牛瘤胃中幾乎沒有成年牛瘤胃中的微生物；6月齡與2歲牛雖然飼喂飼料相同，但瘤胃微生物菌群有著顯著差異；相對于初生牛，成年牛瘤胃微生物環(huán)境更加均衡、嚴格，菌群更趨于多樣化，2歲時瘤胃微生物群落趨于成熟穩(wěn)定；從出生到成年，牛瘤胃中微生物在門水平主要由變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的細菌組成，占主要地位，且隨著年齡的增長變形菌門細菌的數(shù)量下降，2月齡后擬桿菌門數(shù)量雖有變化但基本保持一定水平(圖1)；在出生3 d后普氏菌屬、糞球菌屬(Coprococcus)和水解纖維素有關的瘤胃球菌屬等細菌逐漸增多并表現(xiàn)出一定豐度，逐漸完善了瘤胃功能(表1)。這一趨勢與一項研究人類嬰兒隨著年齡增長大腸微生物變化的報道類似：隨著機體的成熟，消化機能逐步完善，體內微生物種群會逐漸豐富[20]。Koenig等[21]關于嬰兒腸道微生物的研究印證了這一點，同時也指出兒童腸道微生物群落在2.5歲后基本趨于穩(wěn)定。高通量測序的宏基因組技術為研究各個發(fā)育階段微生物提供了充足的數(shù)據(jù)支持，使得整個發(fā)育階段微生物變化脈絡更加清晰完備，且研究更加簡單易行。

圖1 不同年齡階段牛瘤胃微生物門水平變化[19]Fig.1 Microbial composition in different age stages of bovine rumen at phylum level[19].注:a:各年齡階段牛瘤胃微生物門屬水平分布; b、c、d:不同年齡階段各組變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門微生物所占比例，圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

門屬種1日齡(%)3日齡(%)2月齡(%)6月齡(%)2歲齡(%)擬桿菌門Bacteroidetes普氏菌屬Prevotella3.85±3.3548.88±6.9859.68±5.1556.66±5.28擬桿菌目*Bacteroidales1.48±0.820.34±0.160.52±0.140.27±0.05梭菌屬Clostridium2.16±1.021.81±0.350.86±0.155.24±1.194.60±0.67毛旋菌科*Lachnospiraceae0.08±0.023.58±0.735.02±0.737.02±1.03琥珀酸菌屬Succiniclasticum0.22±0.130.76±0.081.35±0.172.01±0.36糞球菌屬Coprococcus0.13±0.111.24±0.381.68±0.231.88±0.20瘤胃球菌屬Ruminococcus0.20±0.131.30±0.441.50±0.201.60±0.11瘤胃菌科*Ruminococcaceae0.67±0.280.80±0.185.30±1.345.56±0.82丁酸弧菌屬Butyrivibrio1.41±0.862.44±0.619.17±1.66梭菌目*ClostridialesFamilyXIII.IncertaeSedis0.15±0.060.99±0.211.38±0.25厚壁菌門Firmicutes月行單孢菌屬Selenomonas0.13±0.020.27±0.071.03±0.22光崗菌屬Mitsuokella0.08±0.010.14±0.020.58±0.20真菌屬Eubacterium0.50±0.050.56±0.070.71±0.04羅氏菌屬Roseburia0.06±0.010.22±0.030.41±0.05假丁酸弧菌屬Moryella0.15±0.010.10±9.03E-050.38±0.10丹毒絲菌屬Bulleidia0.06±0.020.10±0.020.21±0.05毛螺旋菌屬Lachnobacterium0.08±0.040.11±0.020.16±0.04顫螺旋菌屬Oscillospira0.55±0.160.13±0.020.11±0.02毛螺菌屬Lachnospira0.15±0.060.05±5.31E-050.08±0.02變形菌門Proteobacteria毛螺菌屬Lachnospira0.15±0.060.05±5.31E-050.08±0.02琥珀酸弧菌屬Succinivibrio34.45±9.478.45±2.291.41±0.32總和2.168.4495.5393.8595.23

注：各組各個年齡段微生物屬水平微生物平均豐度值，未達屬水平的菌目標以*。

2 基于高通量測序的宏基因組學技術在動物腸道微生物方面的應用研究

除了反芻動物瘤胃中微生物能消化植物纖維以外，在草食動物和雜食動物中，大腸是一個重要的消化器官，機體所需能量的20%左右是從大腸獲取的[1]。在利用現(xiàn)代宏基因組技術研究大腸中微生物的消化作用方面，Ilmberger等[22]對最大的陸地植食性動物—亞洲象大腸微生物群落的研究中，選取3周齡和6歲的亞洲象糞便做 Illumina平臺的高通量宏基因組檢測分析后，分別獲得了380個和3 000個可操作單元(operational taxonomic units，OTUs)及1.1 Gb的DNA contigs，并發(fā)現(xiàn)了84個GH的PULs多屬于擬桿菌門，還包括一些纖維素酶基因。另外，擬桿菌門中，GH5和GH9家族酶表現(xiàn)出較高豐度，可能主要是在亞洲象消化纖維素過程中起作用。

在腸道微生物研究中，應用高通量測序技術可準確獲得腸道微生物群落的分類、豐度信息，為人類研究腸道營養(yǎng)健康提供支持。Ziemer[23]取豬糞便，加纖維素、果膠木聚糖連續(xù)培養(yǎng)8周后，利用基于高通量測序的宏基因組技術得到575種細菌菌株，分屬6門：厚壁菌門(242)、擬桿菌門(185)、變形菌門(65)、梭菌門(55)、放線菌門(23)和互養(yǎng)菌門(5)；與核糖體數(shù)據(jù)庫(ribosomal database project, RDP)比對后，約有30%的細菌為不可培養(yǎng)菌，有179株屬于新的菌種或菌屬。其中厚壁菌門主要由毛旋菌科、腸球菌科、葡萄球菌科及梭菌科I(Clostridiaceae I)組成；擬桿菌門以多形擬桿菌屬、卵形擬桿菌屬及B.木聚糖占主導地位；而厚壁菌和擬桿菌中的大部分菌可產生降解植物細胞壁的酶，參與植物細胞壁的降解消化，與腸道的消化功能有關。之后，Ziemer[24]還對愛荷華州立大學農場的4頭經(jīng)產奶牛糞便取樣，分離細菌繼續(xù)培養(yǎng)8周后同樣采用高通量測序的宏基因組學技術，檢測微生物后并與RDP比對發(fā)現(xiàn)6門、459種菌屬(厚壁菌門51.9%、擬桿菌門30.9%、變形菌門11.1%、放線菌門3.5%、互養(yǎng)菌門1.5%、梭菌門1.1%)，這也僅占所分離細菌的近98.5%；厚壁菌門主要有鞭毛菌科、瘤胃菌科、丹毒菌科及梭菌科(Clostridiaceae I)；擬桿菌門主要是卵形多形擬桿菌B.及木聚糖溶解酶B.。類似地，de Oliveira等[25]對巴西Nelore閹牛瘤胃、小腸、大腸內容物做16S rRNA基因高通量測序檢測后也發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和擬桿菌門微生物為各個組織部位的主要菌群。Ni等[26]對24條草魚大腸微生物做宏基因組檢測后發(fā)現(xiàn)有116種古菌和1 112種細菌，且主要為厚壁菌門、變形菌門和梭菌門細菌。Singh等[27]采用高通量測序對飼料轉化率不同的印度“MY”肉雞糞便中微生物菌群檢測后，與RDP、小分子rRNA數(shù)據(jù)庫(SSU rRNA database)及SEED數(shù)據(jù)庫(SEED database)比對后發(fā)現(xiàn)，微生物中細菌占95%以上，其次依次為真核生物(>2%)、古菌(>0.2%)和病毒(>0.2%)；在門水平，兩組微生物中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門含量依次降低，在高、低飼料轉化率肉雞糞便樣品的微生物群落中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門含量依次為52.04%和78.83%、27.53%和11.97%、17.53%和7.10%。通過高通量測序的宏基因組學技術對動物腸道微生物測序，然后比對數(shù)據(jù)庫，確定這些腸道微生物的主要功能，為后續(xù)動物腸道營養(yǎng)健康研究提供了方法。

3 基于高通量測序的宏基因組學技術在特定功能微生物篩選中的應用

草食動物可直接消化利用植物，主要是草食動物體內微生物在特定條件下可以產生相關的降解酶類，來消化降解植物細胞壁。因此，我們可以通過研究動物體內微生物降解纖維的生物機理，人工干預微生物微環(huán)境，調節(jié)微生物代謝向著人類希望的方向發(fā)展；相似地，我們也可通過對草食動物體內微生物的研究，篩選出具有特定功能的微生物應用于工業(yè)發(fā)酵等行業(yè)。因此，在應用基于高通量測序的宏基因組學技術于動物研究的同時，也可用在對特定功能微生物篩選的研究中。

例如，López-Cortés等[28]在研究牛瘤胃微生物時，發(fā)現(xiàn)一種新的木聚糖水解酶——乙?；揪厶酋ッ福籔alackal等[29]在牛腸道微生物中分離出復合糖基水解酶；Weimer和Stevenson[30]從牛瘤胃中分離出可產乙酸的芽孢桿菌；Liu等[31]應用宏基因組學技術從中國荷斯坦牛瘤胃中分離鑒定出一個新的厭氧型、適溫、一氧化碳氧化產氫菌，并從構建的宏基因組文庫中獲得2個新的脂解酶RlipE1和RlipE2基因。Wang等[32]對牦牛瘤胃內容物應用高通量測序的宏基因組技術構建宏基因組文庫并測序，篩選出14個屬于水解酶10家族(GH10)的木聚糖酶蛋白，這些木聚糖酶的氨基酸序列相似度為20.5%～91.3%，并且7個木聚糖酶基因與木糖苷酶基因有著不同的contigs；Larsbrink等[33]對奶牛瘤胃微生物宏基因組進行高通量測序后得到27 755個碳水化合物水解酶候選基因，可編譯90種候選蛋白，并且其中57%的候選基因可通過酶促作用，激活抗纖維素底物相關酶類。Pope等[34]在對馴鹿瘤胃消化木質纖維素相關微生物的宏基因組學研究中，除了發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和厚壁菌門為主要作用的微生物以外，還鑒定出一種新的擬桿菌分支菌SRM-1，分析后發(fā)現(xiàn)其具有多個PULs，分泌20種GH和其他多種靶向碳水化合物水解酶，包括木聚糖、果膠和纖維素水解酶類。Gruninger等[35]對從飼喂青草、干草的奶牛瘤胃內容物建立宏基因組文庫后鑒定出一種具有高β-葡萄糖苷酶活性的蛋白Bgxa1(beta-glucosidase/beta-xylosidase/alpha-arabinosidase gene)，Bgxa1可高效抗p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-beta-d-glucopyranoside (pNPG))、纖維二糖(cellobiose)、p-硝基苯基-β-D-木吡喃糖苷(p-nitrophenyl-beta-d-xylopyranoside (pNPX))及p-硝基苯基-α-D-阿拉伯糖苷(p-nitrophenyl-alpha-d-arabinofuranoside (pNPAf))。Bgxa1的動力學分析顯示其對以上三種糖苷的催化活性高低依次為pNPG>pNPAf>pNPX；Bgxa1的催化活性是β-木糖苷酶和α-阿拉伯糖苷酶的100倍，對木質纖維素材料有較好的糖化作用。Li等[36]對飼喂中國芒草的肉牛瘤胃微生物運用宏基因組學技術，建庫后篩選、克隆、鑒定出一種新的編碼β-糖苷水解酶的基因unglu135B12，該基因編碼一個779氨基酸的多肽鏈，具有一個GH3催化位點，最適酶活條件為pH 5.0、38℃。

4 展望

經(jīng)過千百萬年以來的自然選擇和遺傳進化，草食性動物和雜食性動物具有了特有的消化利用植物資源的生理功能，主要是其胃腸道適應了寄生微生物，構成了一定的微生物穩(wěn)態(tài)。在這種特殊的微生物環(huán)境中，經(jīng)過微生物的發(fā)酵，降解植物纖維為動物體所能吸收的營養(yǎng)物質，大幅提高了資源的利用率。研究并利用這一特殊的生理特性，使得人工干預微生物高效利用植物資源成為可能。而且，現(xiàn)今人們已經(jīng)清楚的認識到生物體的生理代謝和生長發(fā)育除了受自身基因的調控外，還受到多條件的影響調控，其中就包括機體中的微生物。基于高通量測序的宏基因組技術的進步，使人們能盡可能全面地掃描到一些特殊微生物環(huán)境中的微生物基因，挖掘出更多以前尚未發(fā)現(xiàn)的功能性基因，以及更多的不可培養(yǎng)微生物，在很大程度上豐富了微生物基因庫。另外，隨著現(xiàn)代宏基因組技術在生物體內微生物研究中的應用，為人們更加全面掌握生物體機能代謝、營養(yǎng)調控以及疾病免疫預防等，提供了更為方便可靠的技術支持。而且，隨著生物工程技術的發(fā)展，生物體內微生物的相關研究，也為生物制劑生產、生物發(fā)酵工程等微生物應用領域研究提供了幫助。

在生物體相關微生物的研究中，人類體內微生物研究走了最前面，例如在2007年及2008年，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)及歐盟委員會(European Commission，EC)分別啟動了“人類生物組計劃”(Human Microbiome Project，HMP)和“人類腸道宏基因組學” (Metagenomics of Human Intestinal Tract，MetaHIT)計劃，分別資助約1.15億美元和2 770萬美元，由美國、歐盟、中國、日本等多國參與合作，第一階段資助已經(jīng)完成，但由于微生物菌群的復雜特性及科技制約取得的成果與預期效果仍有差距。

雖然基于高通量測序技術的基因組技術相對于傳統(tǒng)研究微生物的方法而言，在獲得微生物數(shù)據(jù)量、可操作性等方面有了很大進步，但仍不夠完善。比如，現(xiàn)在的高通量測序技術都是將DNA剪切為小片段后，再單個連接小片段DNA至一定的固相表面單獨擴增后拼接并檢測信號。DNA拼接越長難度越大，從而完美的片段閾值難以完全控制，存在一定的誤差。另一方面，高通量測序越來越強的測序深度及越來越大的數(shù)據(jù)輸出也導致現(xiàn)有算法難以完全利用如此龐大的數(shù)據(jù)量，不但造成數(shù)據(jù)的浪費并在一定程度上這也導致在后期數(shù)據(jù)分析過程中制約了高通量測序技術在宏基因組學方面的應用。但是，相信隨著科技的進一步發(fā)展，下一代優(yōu)化測序技術的改進，或者新研究方法的出現(xiàn)，一定可以使人類對于微生物研究更加深入、了解的更加透徹，從而幫助人類徹底解決生物體與微生物之間的種種謎題。

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