余愛麗, 趙晉鋒, 張晏萌, 張 正, 郭二虎

1.山西省農(nóng)業(yè)科學院谷子研究所, 山西 長治 046011;2.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 河北 保定 071001

BHMT(betaine-homocysteine methyl transferase)基因存在于動物和微生物體內(nèi)，用于編碼甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶，能夠催化甜菜堿的甲基轉移到高半胱氨酸上，形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸[1]。甲硫氨酸是合成蛋白質(zhì)的必需氨基酸，是構成蛋白質(zhì)的“骨架”氨基酸，甲硫氨酸含量不足將影響其他氨基酸的利用效率，從而影響蛋白質(zhì)的合成[2]。甲硫氨酸是合成腺苷甲硫氨酸(SAM)的底物，SAM是生物體內(nèi)的重要甲基供體。甲基代謝在生物體內(nèi)具有十分重要的意義，很多生物大分子的合成代謝需要甲基的供給，多個基因的表達調(diào)控需要甲基參與[3,4]，如：蛋白質(zhì)、脂類的代謝，DNA、RNA的甲基化等。為此本研究在克隆了豬BHMT基因和構建其原核表達載體的基礎上, 對其進行原核表達分析和表達條件的優(yōu)化, 為進一步目的蛋白的純化和表達研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 pET30a-SsBHMT原核表達載體為本實驗室構建。大腸桿菌(Esherichiacoli)菌株ER2566、BL21為本實驗室保存。

1.1.2實驗藥品 蛋白Marker、SDS、丙烯酰胺、胰蛋白胨、酵母提取物等化學試劑購自上海生工生物工程公司；IPTG購自北京賽百盛基因技術有限公司；Ni-NTA Resin購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1外源基因的誘導表達及可溶性分析 菌種的活化: 取實驗室保存的菌株，在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上“之”字劃線，37℃培養(yǎng)過夜。自平板挑取單菌落，轉接于含卡那的液體培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

取樣: 取培養(yǎng)過夜的菌液，按照1∶100比例轉接于含相應抗生素的培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)2～3 h，當其OD值達0.6～0.8時，取2 mL菌液作對照，記作0 h；剩余菌液分別加入IPTG至終濃度0.4 mmol/L，37℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，誘導2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，各取2 mL，12 000 r/min離心1 min，去其上清，保存于-20℃。

樣品制備: 取所收集菌體，分別加入100 μL 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，2% β-巰基乙醇2 μL，重懸細胞沉淀；冰浴條件下，超聲處理10 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，分別取上清和沉淀物。沉淀中加入100 μL 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，2%β-巰基乙醇2 μL，重懸細胞沉淀。

分析：SDS-PAGE檢測表達蛋白。

1.2.2誘導表達條件優(yōu)化 不同菌株的篩選：將重組載體分別導入菌株ER2566、BL21進行表達分析，具體方法同1.2.1。

目的蛋白表達量最多的株系的篩選：從平板上挑取8個單菌落，IPTG濃度為0.4 mmol/L，進行篩選，具體方法同1.2.1。

IPTG濃度的優(yōu)化：取篩選得到的目的蛋白表達量最多的菌株，分別加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L和1.0 mmol/L進行誘導，具體方法同1.2.1。

IPTG誘導時間的優(yōu)化：取篩選得到的目的蛋白表達量最多的菌株，在IPTG誘導2 h、4 h、6 h、8 h和10 h取樣，具體方法同1.2.1。

超聲時間的優(yōu)化：設定冰浴超聲處理時間分別為5 min、10 min、15 min和20 min，方法同1.2.1。

1.2.3目的蛋白的純化 經(jīng)優(yōu)化條件誘導后，離心收集菌體，加入裂解液，超聲破碎，離心收集上清沉淀，沉淀用8 mol/L尿素溶解后，用Ni2+親和柱純化(參照說明書)，SDS-PAGE 鑒定。

2 結果與分析

2.1 外源基因的誘導表達及可溶性分析

含有外源基因菌株ER2566(pET30a-SsBHMT)和不含外源基因菌株ER2566(pET30a)在37℃，經(jīng)過IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)誘導2 h、4 h、6 h、8 h和10 h后，SDS-PAGE分析見圖1和圖2，結果表明：沉淀和上清中，在蛋白Marker的45 kDa與66 kDa的條帶之間有一條明顯的條帶，與預測目的蛋白條帶的分子量(約為51 kDa)相吻合；沉淀中的目的蛋白的表達量明顯高于上清；目的蛋白以可溶性蛋白和包涵體兩種形式表達，但主要以包涵體的形式存在。

2.2 不同菌株對目的蛋白表達的影響

將構建的原核表達載體pET30a-SsBHMT分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)和ER2566菌株，分析結果如圖3，目的蛋白在ER2566中明顯表達，且在沉淀中的表達量明顯高于上清液中的表達量。但目的蛋白在BL21中不表達或表達不明顯，說明不同菌株也影響目的蛋白的表達。

圖1 目的蛋白在沉淀中的表達分析Fig.1 Analysis of target protein expression in precipitation.1.ER2566(pET30a)誘導6 h； 2.蛋白Marker； 3～8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h.

圖2 上清中目的蛋白的表達分析Fig.2 Analysis of target protein expression in supernatant.1.ER2566(pET30a)誘導6 h； 2.蛋白Marker； 3～8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導0 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h.

圖3 SsBHMT在大腸桿菌BL21(DE3)和ER2566菌株中的誘導表達SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of SsBHMT protein in E.coli BL21(DE3)and ER2566.M.蛋白Marker；1.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀；2.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清；3.ER2566(pET30a-SsBHMT)未誘導；4.ER2566(pET30a)沉淀；5.ER2566(pET30a)上清；6.BL21(pET30a-SsBHMT)沉淀；7.BL21(pET30a-SsBHMT)上清

2.3 同一菌株不同株系對目的蛋白表達的影響

從平板上隨機挑8個單菌落，IPTG(終濃度為0.4 mmol/L)誘導2 h以后，分析結果表明：4號菌株在沉淀中目的蛋白表達量最多(圖4)；上清中除5號菌外，2、4號菌表達量略低，其余目的蛋白表達量接近(圖5)。

2.4 IPTG濃度對目的蛋白表達量的影響

沉淀中目的蛋白表達量最多的菌株，不同濃度的IPTG(0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L)誘導2 h，分析結果表明：在未加IPTG時，沒有目的蛋白的表達；在IPTG濃度為0.3 mmol/L時，目的蛋白表達；在IPTG濃度為0.4 mmol/L時，目的蛋白的表達量微量上調(diào)，之后隨IPTG濃度的增大，目的蛋白的表達量減少(圖6)。所以0.4 mmol/L為此菌株的最佳IPTG誘導濃度。

圖4 篩選在沉淀中表達最優(yōu)的菌株Fig.4 Screening optimal bacteria expressed in precipitation.M：蛋白Marker；1～8：從平板上挑的8個單菌落

圖5 篩選在上清中表達最優(yōu)的菌株Fig.5 Screening optimal bacteria expressed in supernatant.M：蛋白Marker； 1～8：從平板上挑的8個單菌落

圖6 不同IPTG濃度對目的蛋白在沉淀中表達量的影響Fig.6 Effects of IPTG concentration on the recombinant protein expressed in precipitation.M：蛋白Marker；1～9. IPTG濃度分別為0 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L

2.5 IPTG誘導時間對目的蛋白表達量的影響

沉淀中目的蛋白表達量最大的菌株，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，經(jīng)過不同時間誘導后，結果表明：沉淀中，IPTG誘導2 h時，目的蛋白開始表達；并且隨著誘導時間的延長，表達量明顯增加；IPTG誘導10 h時，目的蛋白的表達量最大(圖7)。上清中目的蛋白的表達量隨時間變化無明顯變化(圖8)。

圖7 不同IPTG誘導時間對目的蛋白在沉淀中表達量的影響Fig.7 Effects of induction time on the target protein expression in precipitation.1.ER2566(pET30a)誘導6 h； 2.蛋白Marker； 3～8. ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h

圖8 不同IPTG誘導時間對目的蛋白在上清中表達量的影響Fig.8 Effects of induction time on the target protein expression in supernatant.1.ER2566(pET30a)誘導6 h；2.蛋白Marker；3～8.ER2566(pET30a-SsBHMT)誘導0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h.

2.6 超聲時間對目的蛋白提取量的影響

沉淀中目的蛋白表達量最多的菌株，0.4 mmol/L IPTG誘導2 h后，經(jīng)不同的冰浴超聲破碎時間5 min、10 min、15 min、20 min破碎，結果見圖9，超聲5 min時，沉淀中目的蛋白提取量略大；上清中目的蛋白表達量變化不明顯(圖10)。

圖9 不同超聲時間對目的蛋白在沉淀中提取量的影響Fig.9 Effects of different ultrasonic time on the target protein extraction in precipitation.1.ER2566(pET30a)對照；2～5.超聲5 min、10 min、15 min、20 min；M.蛋白Marker

圖10 不同超聲時間對目的蛋白在上清中提取量的影響Fig.10 Effects of different ultrasonic time on the target protein extraction in supernatant.M.蛋白Marker； 1.ER2566(pET30a)對照； 2～5.超聲5 min、10 min、15 min、20 min

2.7 目的蛋白的純化

上清和沉淀的純化結果如圖11所示，沉淀純化結果明顯，在45～66 kDa之間有一條帶，無雜蛋白，但上清純化無結果。

圖11 SsBHMT蛋白的純化Fig.11 Purification of SsBHMT protein.1.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀純化；2.ER2566(pET30a-SsBHMT)沉淀；3.蛋白Marker; 4.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清；5.ER2566(pET30a-SsBHMT)上清純化

3 討論

原核細胞表達體系是目前研究最深入、應用最廣泛的表達系統(tǒng)，它具有真核表達體系無可比擬的優(yōu)點，成本低廉、外源基因表達量大等[5]。原核表達載體系統(tǒng)pET功能非常強大，可通過目的蛋白的特點、IPTG濃度的調(diào)節(jié)等方法來調(diào)控目的蛋白的表達水平，通過載體上的His-Tag標簽純化蛋白，特別適用于那些以包涵體形式表達的蛋白，使蛋白純化過程變得簡單高效。為此本研究中選用pET載體對外源基因BHMT進行表達，結果發(fā)現(xiàn)BHMT基因在原核細胞BL21(DE3)中不表達或表達不明顯，在ER2566中主要以包涵體的形式表達，而且在不同ER2566(pET30a-SsBHMT)株系中表達量不同。前期實驗28℃和37℃兩個誘導溫度實驗結果表明，溫度對目的蛋白的表達差異不大(未列出)，于是進行了IPTG誘導濃度、誘導時間的優(yōu)化，結果表明篩選到的沉淀中目的蛋白表達量最多的菌株，在37℃，IPTG濃度為0.4 mmol/L，誘導時間為10 h時，沉淀中的表達量最多，但仍主要以包涵體的形式表達，分析其原因可能與菌株有關[6]，也可能與pH、溫度[7～9]、真核生物密碼子偏愛性及氨基酸的組成等有關[10]。本研究結果與已有研究結果一致，表明不同重組載體的最佳表達條件不同，不同重組載體在同一菌株的最適條件也不相同，每種重組載體的最適表達條件都需要進行特定的優(yōu)化[11～15]，如黑山羊基因MSTN[BL21-pET-32a(+)-MSTN69]的最優(yōu)表達條件為31℃，IPTG 0.8 mmol/L誘導5 h[12]； 番茄谷胱甘肽轉移酶基因ShGSTU1在大腸桿菌BL21(pET28a)中的最佳表達條件為37℃，1 mmol/LIPTG誘導4 h；在BL21(pET32a)中最佳表達條件為30℃，1 mmol/L IPTG誘導5 h[15]。另外對不同超聲破碎時間分析發(fā)現(xiàn)，超聲時間對目的蛋白的純化影響不大。本研究優(yōu)化了目的基因在原核細胞中表達的條件，使得目的基因在原核細胞中的表達量明顯增加，為進一步純化目的蛋白、制備抗體奠定了基礎。

[1] Garrow T A. Purification, kinetic properties, and cDNA cloning of mammalian Betaine homocysteine methyl-transterase[J]. J. Biol. Chem., 1996, 271: 22831-22838.

[2] 麻益良，何瑞國.飼料添加劑蛋氨酸在養(yǎng)禽業(yè)中的應用[J].山東家禽,1999,2:25-28

[3] Amir R. Current understanding of the factors regulating methionine content in vegetative tissues of higher plants[J]. Amino Acids, 2010, 39:917-931

[4] 蘇 玉, 王 溪, 朱衛(wèi)國.DNA 甲基轉移酶的表達調(diào)控及主要生物學功能[J].遺傳,2009,31(11): 1087-1093

[5] Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual[M](3rdeds). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002,934

[6] 張秀香,袁子國,李景文,等.LTB-MOMP融合基因表達載體的構建及其在原核細胞中的表達[J]. 中國生物制品學雜志,2008,21(6):449-451,456.

[7] 葉 姣,陳長華,夏 杰,等.溫度對重組大腸桿菌生長及外源蛋白表達的影響[J]. 華東理工大學學報, 2002,28(2):364-367.

[8] Donovan R S, Robinson C W, Glick B R. Review:optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of the lac promoter[J]. J. Ind. Microbiol., 1996,16(3):145-154.

[9] Carte R P, Kelley R F, Rodrigues M L,etal.. High levelEscherichiacoliexpression and production of a bivalent humanized antibody fragment [J]. Biotechnology , 1992,10:163-167.

[10] Peter E V.E.coliGene Expression Protocols [M]. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc., 2003,335-338.

[11] 張雪利,魯義善,謝吉國,等. 紅笛鯛重組激活基因rag1原核表達條件的優(yōu)化及純化[J]. 廣東海洋大學學報，2012,32(1):11-16.

[12] 石照應,曲月秀,陳 蓉,等.貴州黑山羊MSTN基因原核表達條件優(yōu)化及蛋白純化[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2012,25(6):2343-2346.

[13] 呂 彤，劉 揚，趙 青，等. 烯酮還原酶基因的克隆與優(yōu)化表達[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2011,17(1): 87-90.

[14] 孫 濤,申 寧,白 羽,等. 海棲熱袍菌極耐高溫木聚糖酶基因xynB64在大腸桿菌中的融合表達[J]. 微生物學通報，2011,38(7):1090-1097.

[15] 裴冬麗，張紅巖，李 萌，等.番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表達條件優(yōu)化[J].河南大學學報:自然科學版,2014,44(2):202-207.