林龍鎮(zhèn)，萬云鳳，洪文榮

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，中國 福州 350108)

金霉素生物合成基因ctcK的研究

林龍鎮(zhèn)，萬云鳳，洪文榮

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，中國 福州 350108)

為檢測ctcK基因的功能，利用基因工程技術(shù)在金色鏈霉菌J13(StreptomycesaureofaciensJ13)上構(gòu)建ctcK基因缺失工程菌SK12(ΔctcK)，并分析了其次級代謝產(chǎn)物的變化.經(jīng)質(zhì)譜分析顯示，工程菌SK12代謝物中檢測到去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的分子離子峰，但未檢測到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的分子離子峰，這與出發(fā)菌J13代謝物的檢測結(jié)果相反.結(jié)果表明，ctcK基因的失活阻斷了金霉素的生物合成代謝流，使工程菌SK12主要積累去甲基金霉素，顯示ctcK基因參與金霉素C-6位甲基化.本研究初步闡明了ctcK基因的功能，同時獲得了一株主產(chǎn)去甲基金霉素的工程菌.

ctcK基因；去甲基金霉素；甲基化；生物合成；金色鏈霉菌

金霉素(CTC)是一類臨床上主要用于治療革蘭氏陽性球菌，特別是葡萄球菌(Staphylococcus)、肺炎球菌(Streptococuspneumoniae)的四環(huán)類廣譜抗生素.除了抗生和抗炎功效之外[1-3]，自20世紀(jì)80年代以來，科學(xué)家還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)金霉素具有抗腫瘤活性[4]、非抗菌作用[5]及非抗感染用途[6].去甲基金霉素(DMCTC)，亦屬于四環(huán)類抗生素，與金霉素相比在C-6位少了一個甲基.去甲基金霉素不僅對革蘭氏陽性和陰性菌有抑菌活性，對衣原體(Chlamydia)、立克次體(Rickettsia)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumonia)等致病性病毒亦有很好的抑制效果.與金霉素相比，去甲基金霉素不僅抗菌活力更強(qiáng)、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、還因具有易被人體吸收、排泄快、長效性和高效性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用.此外，它還是合成米諾環(huán)素和替加環(huán)素的重要母體[7].

金霉素生物合成途徑和生物合成基因的相關(guān)研究不多[8-10].2013年，鄧子新團(tuán)隊報道了金霉素生物合成基因簇并確定了鹵化酶基因，同時還推測ctcK基因可能是金霉素C-6位甲基化酶基因，但至今仍未經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明(GenBank：HM627755)[11].基于本實(shí)驗(yàn)室已建立的大腸桿菌(Escherichiacoli)與金色鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移體系[12-13]，本研究采用基因框內(nèi)敲除方法，特異性滅活ctcK基因，分析ctcK基因失活突變株代謝產(chǎn)物的變化，旨在闡明ctcK基因在金霉素pretetramid到6-methylpretetramid生物轉(zhuǎn)化中的作用，進(jìn)而驗(yàn)證ctcK基因是否為金霉素C-6位甲基化酶基因.研究結(jié)果可間接獲得主產(chǎn)去甲基金霉素的工程菌，為開發(fā)去甲基金霉素等系列藥物奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 金色鏈霉菌J13，大腸桿菌top10，大腸桿菌ET12567(pUZ8002)，大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pKC1139及pJTU412均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆載體pMD19-T購自TaKaRa公司.

1.1.2 培養(yǎng)基與抗生素 金色鏈霉菌斜面培養(yǎng)基及預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基見文獻(xiàn)[13]，種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基見文獻(xiàn)[14]；大腸桿菌生長培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基[15].本研究中使用的抗生素及其終濃度分別為：氨芐青霉素 100 mg/L，安普霉素 50 mg/L，氯霉素 25 mg/L，卡那霉素 50 mg/L，萘啶酮酸 25 mg/L.

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；溶菌酶，RNase A酶，Proteinase K和DNA凝膠回收試劑盒均購自上海生工公司；其他常規(guī)試劑見文獻(xiàn)[16].

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 以金霉素生物合成基因簇(GenBank：HM627755)為模板，設(shè)計兩對引物K1/K2和K3/K4，分別用于擴(kuò)增ctcK基因上游交換臂KB1和下游交換臂KB2；再根據(jù)同源重組原理，設(shè)計兩對篩選單交換和雙交換的鑒定引物K5/K6和K7/K8；引物序列及其限制酶見表1.

表1 本研究所用引物

1.2.2 分子克隆 PCR、酶切、酶連、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及其轉(zhuǎn)化、小量質(zhì)粒DNA提取，方法參見實(shí)驗(yàn)手冊[17]；金色鏈霉菌染色體DNA提取參見鏈霉菌遺傳操作手冊[16]；DNA測序委托上海生工公司.

1.2.3 單交換突變株篩選 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567(pUZ8002)，再通過接合轉(zhuǎn)移方法將其導(dǎo)入金色鏈霉菌J13.35 ℃培養(yǎng)16～20 h后，覆蓋30 mg/L安普霉素和25 mg/L萘啶酮酸，繼續(xù)在35 ℃培養(yǎng)，4 d后長出接合子.挑取其中一株命名為金色鏈霉菌SK11，簡稱SK11，提取其基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證.接合轉(zhuǎn)移具體方法見文獻(xiàn)[14].

1.2.4 雙交換突變株篩選 將單交換工程菌在斜面培養(yǎng)基上松弛培養(yǎng)5代，然后分離單菌落，將單菌落影印至含安普霉素的抗性平板和不含抗生素的普通平板上.培養(yǎng)5 d后，從887株菌中篩選得到1株安普霉素敏感菌株，命名為金色鏈霉菌SK12，簡稱SK12，提取其基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證.

1.2.5 發(fā)酵及代謝產(chǎn)物組分檢測 對菌株進(jìn)行分離純化，獲得長勢較好的單菌落，轉(zhuǎn)接斜面35 ℃培養(yǎng)5～7 d，待斜面孢子豐滿.刮取適量的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，32 ℃，280 r/min振蕩培養(yǎng)18～22 h，使菌體處于對數(shù)生長期.再按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，29 ℃，265 r/min，發(fā)酵72 h.放瓶后，將發(fā)酵液用草酸酸化至pH 1.2～1.5，并于4 ℃靜置30 min，以釋放效價.再依次加入0.1%～0.2%的黃血鹽及0.1%～0.2%的硫酸鋅，不斷攪拌10 min，以除去蛋白.然后4 ℃，12 000 r/min，離心5 min，取上清，經(jīng)甲醇稀釋5倍，過0.22 μm濾膜，所得樣品直接用于高效液相色譜分析.樣品經(jīng)甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，再過0.22 μm濾膜，用于質(zhì)譜分析.

1.2.6 高效液相色譜條件及質(zhì)譜方法 液相色譜條件：采用島津液相色譜儀LC-20A和SinoChrom ODS-BP色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)進(jìn)行分析；流動相中V(甲醇)∶V(10 mol/L甲酸)=20∶80；流速：1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量：10 μL.

質(zhì)譜掃描條件：采用Exactive Plus高分辨質(zhì)譜儀和電噴霧離子化源(ESI源)進(jìn)行測定；極性檢出模式：正模式(MS+)；毛細(xì)管電壓：3 800 V；干燥氣：N2；流速：6 L/min；干燥氣溫度：320 ℃；檢測方式：一級全掃描.

2 結(jié)果與分析

2.1 CtcK蛋白序列基本性質(zhì)分析

通過生物信息學(xué)軟件Vector.NTI 11.5查找已公布的金霉素生物合成基因簇(GenBank:HM627755)并將ctcK基因序列翻譯成CtcK蛋白氨基酸序列.使用瑞士生物信息中心引擎(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在線分析軟件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析此蛋白氨基酸的親疏水性和跨膜區(qū)，可知CtcK蛋白以疏水性氨基酸為主，且CtcK蛋白不具有跨膜區(qū)，蛋白全部在膜外.

2.2 CtcK蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能分析

圖1 CtcK蛋白三維結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Tertiary structure of CtcK

將CtcK蛋白氨基酸序列通過SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模，經(jīng)Rasmol軟件進(jìn)行顯示和分析，結(jié)果如圖1(彩圖見封三).該蛋白含有兩條肽鏈，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主.再經(jīng)蛋白保守結(jié)構(gòu)域在線分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)表明CtcK中76 aa～317 aa組成SAM依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域.因此推測ctcK基因可能是負(fù)責(zé)催化金霉素C-6位甲基化酶的基因.

2.3 重組質(zhì)粒pJTK2的構(gòu)建

以J13的染色體DNA為模板，用兩對引物K1/K2和K3/K4分別擴(kuò)增上游交換臂KB1(2 033 bp)和下游交換臂KB2(2 051 bp).PCR樣品經(jīng)電泳檢測后，回收目標(biāo)條帶并進(jìn)行TA克隆，得到中間質(zhì)粒pTK1和pTK2.質(zhì)粒pTK1和pTK2分別經(jīng)XbaⅠ/EcoRⅤ和EcoRⅤ/EcoRⅠ雙酶切后，回收KB1和KB2片段；質(zhì)粒pJTU412經(jīng)XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，回收7 879 bp的片段并與KB1和KB2片段進(jìn)行酶連，構(gòu)建質(zhì)粒pJTK1；最后，用EcoR Ⅰ對質(zhì)粒pJTK1和puc30-apr分別進(jìn)行單酶切，分別回收11 951 bp和1 168 bp的片段，再次酶連，經(jīng)篩選得到最終質(zhì)粒pJTK2(pJTU412∶∶KB1∶∶KB2∶∶apr)，其酶切驗(yàn)證見圖2-B.該質(zhì)粒以KpnⅠ/BglⅡ雙酶切，得到5 234，3 766，2 978和1 141 bp四條帶；用EcoR Ⅰ/XbaⅠ雙酶切，得到7 879，4 072，1 141和27 bp四條帶；用EcoR Ⅴ/HindⅢ雙酶切，得到9 289，2 855和975 bp三條帶；pJTK2經(jīng)以上3種方式酶切，電泳條帶大小均與理論預(yù)測一致，克隆系列經(jīng)測序與預(yù)測吻合.由此，重組質(zhì)粒pJTK2構(gòu)建完畢.

圖2 質(zhì)粒pJTK2的物理圖譜(A)及其酶切鑒定圖(B)

Fig.2 Schematic diagram of plasmid pJTK2 (A),and validation of pJTK2 by endonuclease (B)

2.4 金色鏈霉菌SK12重組菌株的構(gòu)建

接合轉(zhuǎn)移得到的突變株SK11，用引物K5/K6擴(kuò)增到1 559 bp和2 300 bp片段，PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果與理論預(yù)測大小一致，初步確定為單交換菌株，電泳結(jié)果見圖3-B泳道2.

影印篩選得到的突變株SK12，用引物K5/K6和K7/K8分別擴(kuò)增到1 559 bp和2 454 bp片段，與親株相比均缺失了741 bp片段，電泳結(jié)果見圖3-B泳道3和6.經(jīng)測序分析，證明SK12確實(shí)為ctcK基因框內(nèi)缺失工程菌.

圖3 pJTK2質(zhì)粒與J13染色體DNA同源重組示意圖(A)及其突變株P(guān)CR鑒定電泳圖(B)

Fig.3 Diagram showing the homologous recombination of plasmid pJTK2 and J13 chromosomal DNA (A),and PCR assay for the verification of the mutants (B)

2.5 工程菌SK12的菌落形態(tài)及代謝產(chǎn)物分析

ctcK基因缺失工程菌SK12的基內(nèi)菌絲體為棕紅色，而親株J13為棕黃色.除此之外，工程菌SK12與親株J13的孢子顏色均為棕灰色，且生長周期相同，這與程惠芳所報道的去甲基金霉素突變株的菌落形態(tài)相符[18].繼續(xù)用傳代方法將SK12傳5代后，其菌落形態(tài)依舊保持穩(wěn)定.將SK12和J13按1.2.5方法進(jìn)行發(fā)酵及代謝產(chǎn)物組分分析，經(jīng)高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖4.J13樣品(圖4，c)與金霉素標(biāo)準(zhǔn)品(圖4，a)主峰保留時間基本相近，分別為31.193 min和32.184 min，因此認(rèn)為31.193 min的峰為金霉素峰.SK12樣品(圖4，d)與去甲基金霉素標(biāo)準(zhǔn)品(圖4，b)主峰保留時間也基本相近，分別為20.260 min和19.712 min，因此認(rèn)為20.260 min的峰為去甲基金霉素峰.據(jù)此可知，與親株J13(圖4，c)相比，工程菌SK12(圖4，d)不再合成金霉素，而主產(chǎn)去甲基金霉素，說明ctcK基因的缺失阻斷了金霉素的合成，使金霉素合成代謝積累在去甲基金霉素，顯示ctcK基因參與C-6位甲基化.

(a) 0.5 g/L金霉素標(biāo)準(zhǔn)品； (b) 0.5 g/L去甲基金霉素標(biāo)準(zhǔn)品； (c) 出發(fā)菌J13樣品； (d) 工程菌SK12樣品圖4 J13和SK12代謝產(chǎn)物高效液相色譜分析圖Fig.4 HPLC analysis of metabolites from J13 and SK12

由于金霉素及去甲基金霉素含有氯原子，因此有典型的[A+2]同位素峰，且[A]∶[A+2]≈3∶1.而四環(huán)素不含氯原子，所以沒有[A+2]同位素峰.質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，出發(fā)菌J13代謝產(chǎn)物中檢測到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=481.12 [M+H]+，且兩者豐度比約為3∶1，與理論相符，檢測結(jié)果見圖5.此外，J13代謝產(chǎn)物中還檢測到四環(huán)素的準(zhǔn)分子離子峰m/z=445.16 [M+H]+，但未檢測到去甲基金霉素的離子峰，這可能是由于去甲基金霉素相對含量較低，因此未能檢測出來.另外，質(zhì)譜圖中的離子峰m/z=146.08 [M+H]+，m/z=161.09 [M+H]+，m/z=282.28 [M+H]+，m/z=338.34 [M+H]+，m/z=381.08 [M+H]+，m/z=527.16 [M+H]+可能是碎片峰或雜質(zhì)峰，因?yàn)樵诮鹈顾厣锖铣赏緩街芯鶝]有相應(yīng)質(zhì)量數(shù)的中間代謝產(chǎn)物.與親株J13相反，工程菌SK12代謝產(chǎn)物中檢測到了去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰及其[A+2]的同位素峰m/z=467.10 [M+H]+，但未檢測到金霉素和四環(huán)素的離子峰.質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步說明ctcK基因的缺失阻斷了金霉素的合成，使金霉素合成代謝積累在去甲基金霉素，初步闡明了ctcK基因負(fù)責(zé)參與催化C-6位甲基化.此外，SK12代謝產(chǎn)物中檢測到m/z=365.10 [M+H]+(6-Pretetramid)的離子峰，但未檢測到m/z=351 [M+H]+(Pretetramid)的離子峰，這可能是因?yàn)閏tcK基因的缺失不能完全阻斷Pretetramid到6-Pretetramid 的代謝流.當(dāng)然，也有可能是因?yàn)閙/z=365.10 [M+H]+不是6-Pretetramid的離子峰，而是碎片峰或雜質(zhì)峰.

圖5 J13和SK12代謝產(chǎn)物質(zhì)譜分析圖Fig.5 MS analysis of metabolites from J13 and SK12

2.6ctcK基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

以金色鏈霉菌J13的基因組DNA為模板，通過K1/K4引物PCR擴(kuò)增KB3片段(4 811 bp)，將其克隆到pMD19-T載體，得到陽性克隆子，提取其質(zhì)粒，并命名為質(zhì)粒pKB11.質(zhì)粒pKB11和質(zhì)粒pKC1139分別用XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切，再經(jīng)回收、酶連、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆子，獲得ctcK基因回補(bǔ)同源重組質(zhì)粒pKB12(pKC1139∶∶KB3)，其酶切驗(yàn)證見圖6-B.將pKB12轉(zhuǎn)入ET12567(pUZ8002)，并通過接合轉(zhuǎn)移方法將其導(dǎo)入工程菌SK12中，篩選獲得一株pKB12質(zhì)粒整合到SK12染色體上的重組菌株，命名為金色鏈霉菌SK13.由于該重組菌株存在同源片段，容易發(fā)生二次重組.因此可通過影印篩選獲得ctcK基因回復(fù)突變株SK14(簡稱SK14)，PCR電泳檢測結(jié)果見圖7-B.將SK14按照1.2.5中的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并用高效液相色譜對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析.結(jié)果表明，SK14(圖8，b)重新主產(chǎn)金霉素，與親株J13(圖8，a)相比沒有明顯差異，進(jìn)而再次證明ctcK基因是負(fù)責(zé)參與催化C-6位甲基化的基因.

圖6 質(zhì)粒pKB12的物理圖譜(A)及其酶切鑒定圖(B)

Fig.6 Schematic diagram of plasmid pKB12 (A),and validation of pKB12 by endonuclease (B)

圖7 pKB12質(zhì)粒與SK12染色體DNA同源重組示意圖(A)及其回復(fù)突變株P(guān)CR鑒定圖(B)

Fig.7 Diagram showing the homologous recombination of plasmid pKB12 and SK12 chromosomal DNA (A),and PCR assay for the verification of the reverse mutant (B)

圖8 J13(a)和SK14(b)代謝產(chǎn)物高效液相色譜分析圖Fig.8 HPLC analysis of metabolites from J13(a) and SK14(b)

3 結(jié)論與討論

四環(huán)類抗生素生物合成過程中，C-6甲基化酶基因一直是研究熱點(diǎn)，但至今仍未完全闡明.2007年，Zhang等將龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)oxyF基因進(jìn)行異源表達(dá)，證實(shí)了OxyF為土霉素C-6位甲基化酶，負(fù)責(zé)pretetramid 到6-methylpretetramid的生物轉(zhuǎn)化過程，且表明OxyF對pretetramid底物具有高度特異性[19].本研究在此基礎(chǔ)上，通過序列比對發(fā)現(xiàn)ctcK基因與oxyF基因序列同源性高達(dá)74.4%，且經(jīng)生物信息學(xué)分析再次發(fā)現(xiàn)CtcK蛋白中亦存在SAM依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，因此推測ctcK基因可能參與金霉素C-6位甲基化.據(jù)此，本研究利用基因敲除技術(shù)滅活ctcK基因，獲得ctcK基因失活突變菌SK12(ΔctcK).經(jīng)HPLC及MS分析顯示，工程菌SK12不再合成金霉素，主要積累去甲基金霉素，與出發(fā)菌J13主要積累金霉素明顯不同，說明ctcK基因的失活阻斷了金霉素的生物合成代謝流，使工程菌積累去甲基金霉素，初步闡明了ctcK基因參與C-6位甲基化.此外，ctcK基因的缺失并沒有使代謝積累pretetramid，而是繼續(xù)合成去甲基金霉素，這可能是由于后續(xù)的下游修飾酶對底物的特異性要求不高，使得pretetramid可以進(jìn)行后續(xù)的一系列氧化、鹵化、轉(zhuǎn)氨及氨二甲基化等修飾作用，最終合成去甲基金霉素.

通過基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，將ctcK基因重新導(dǎo)入工程菌SK12(ΔctcK)中，獲得回復(fù)突變株SK14，其代謝產(chǎn)物主要積累金霉素，與出發(fā)菌J13相同.這與Ryan等將ctc09基因(與ctcK基因序列同源性高達(dá)99.4%)克隆至pLP212281表達(dá)載體，并導(dǎo)入產(chǎn)6-去甲基四環(huán)素的金色鏈霉菌A377中，得到突變株主產(chǎn)四環(huán)素的研究結(jié)果相符[9].這兩個研究結(jié)果不僅表明ctcK基因可能是金霉素C-6位甲基化酶基因，還顯示CtcK可以催化四環(huán)類抗生素pretetramid到6-methylpretetramid的甲基化反應(yīng)，催化途徑如圖9.然而，基因功能的最終確定還須對該基因進(jìn)行體外表達(dá)等一系列研究工作.

圖9 金霉素生物合成過程中ctcK基因催化途徑圖Fig.9 Catalytic pathway of the ctcK in chlortetracycline biosynthesis

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(編輯 WJ)

Study ofctcKin Chlortetracycline Biosynthesis Gene Cluster

LINLong-zhen,WANYun-feng,HONGWen-rong*

(College of Biological Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

In order to detect the function ofctcK,thectcKdeletion mutantS.aureofaciensSK12 (ΔctcK) was constructed inS.aureofaciensJ13 by genetic engineering.Changes of its secondary metabolites were analyzed.The molecular ion peak of demethylchlortetracycline (m/z=465.10 [M+H]+) instead of chlortetracycline (m/z=479.12 [M+H]+) was detected in the metabolites of mutant strain SK12 by MS analyses.This is in contrast to the detection result of metabolites of parent strain J13.These results indicate that the inactivation ofctcKinterdicts chlortetracycline biosynthesis flow and lead to the main accumulation of demethylchlortetracycline in mutant strain SK12,revealing the successful methylation of C-6 of chlortetracycline withctcKinvolved.In this study,the function of thectcKwas preliminarily elucidated.An engineered bacteria that mainly produces monocomponent demethylchlortetracycline has been simultaneously obtained.

ctcK; DMCTC; methylation; biosynthesis;S.aureofaciens

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.01.006

2016-03-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(31070093)；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助項目(2012ZX09201101-008)

* 通訊作者,E-mail：hongwr56@163.com

Q935

A

1000-2537(2017)01-0037-07