劉麗花 李學林*

（1 河南中醫(yī)學院藥學院，鄭州 450000；2 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥學部，鄭州 450000）

樹莓莖葉中原花青素的提取分離效果分析

劉麗花1，2李學林1，2*

（1 河南中醫(yī)學院藥學院，鄭州 450000；2 河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥學部，鄭州 450000）

目的 對樹莓莖葉中的原花青素的提取分離方法進行分析。方法 采用乙醇溶液回流提取法和大孔吸附樹脂分離純化法分別提取樹莓莖葉中的有效成分，并通過TLC法對其有效成分進行定性分析。結果 通過TLC法的顯色劑顯色，未在與對照品相同位置上顯示相應顏色。結論 采用這種方法沒有在樹莓莖葉中提取出來原花青素。

樹莓；原花青素；TLC；實驗研究；中藥化學

樹莓又稱木莓，又名托盤、馬林、覆盆子等，薔薇科Rosaceae植物，主要分布在北半球的寒帶、溫帶，少數(shù)分布在熱帶、亞熱帶和南半球。我國野生資源十分豐富，大約有210種，南北各地均有分布。樹莓不僅是鮮美的生食果品，又可以加工制成果酒、果醬、果汁、蜜餞等，而且還是蜜源植物和藥用植物[1]。樹莓中含有原花青素，是其中的主要的有效成分分，現(xiàn)代藥理研究證明，原花青素具有抗氧化、抗腹瀉、抗?jié)?、抗抑郁、抗癌、抗突變、抑菌、防輻射、降血壓、清除自由基及促進毛發(fā)生長等多種療效[2]。本文以樹莓加工利用過程中的廢棄的莖葉為原料，鑒別并提取其中的原花青素，充分開發(fā)樹莓的利用價值。

1 實驗材料

1.1 儀器 ZN700真空減壓濃縮罐（浙江蒼南縣立甌石化設備有限公司），TO-Z-2型提取罐（浙江蒼南縣立甌石化設備有限公)，300 mm不銹鋼多層過濾器（浙江海寧醫(yī)藥器材廠），AB-8型大孔吸附樹脂（天津市光復精細化工研究所），RE-52A旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮儀器廠），TDL-5-A型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），GL-200型暗箱式雙光紫外儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），CP2250型賽多利斯電子天平（德國）。

1.2 試藥 樹莓（河南省封丘縣青堆樹莓專業(yè)合作社提供），表兒茶素標準品（中國藥品生物制品檢定所），AB-8型大孔吸附樹脂（天津市光復精細化工研究所），甲苯（洛陽昊華化學試劑有限公司），丙酮（天津市福晨化學試劑廠），冰乙酸（西安化學試劑廠），三氯化鐵（天津市凱通化學試劑有限公司），鐵氰化鉀（北京化工廠），香草醛（北京化工廠），硅膠Gf254（上?；瘜W試劑采購供應站），羧甲基纖維素鈉（天津市福晨化學儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 樹莓莖葉的提取和濃縮 取樹莓的莖 (120 kg)、葉(70 kg)，除去雜質，切至2～4 cm的段或絲；加入7倍量75%乙醇，80℃加熱回流提取兩次，每次1.5 h，合并提取液，攪拌均勻；靜置，取上清液，再減壓濃縮至無醇味，取上清液即為上樣液。

2.2 AB-8大孔吸附樹脂預處理 在樹脂柱內(nèi)加入高于樹脂層10～20 cm的乙醇浸泡3～4 h，然后放凈洗滌液，為一次提取過程。用同樣方法反復洗滌至出口洗滌液在試管中加3倍量水不顯混濁為止，后用純水充分淋洗至無明顯乙醇氣味，即可使用。

2.3 提取液的分離純化 采用AB-8大孔吸附樹脂分離純化原花青素[3-4]，取上樣液500 ml，以1000 ml·h-1的流速加入大孔樹脂柱內(nèi)；靜置吸附10 h；再分別用1700 ml的水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，流速為600 ml·h-1，分批收集流出液，減壓濃縮至干，備用。

2.4 原花青素的鑒別

2.4.1 原花青素顯色特征分析 取大孔樹脂純化物，甲醇超聲溶解，點樣，展開劑中展開，分別于日光、254 nm波長下觀察，并采用三氯化鐵、溴水、三氯化鐵-鐵氰化鉀、香草醛-鹽酸、氫氧化鈣溶液等顯色劑顯色，判斷原花青素最顯著的顯色特征。結果見表1。

結合以上結果，三氯化鐵和香草醛-鹽酸兩種顯色劑作為備選，又因三氯化鐵易配置、使用方便，故最終選擇三氯化鐵作為顯色劑。

2.4.2 純化物TLC鑒別 取大孔樹脂純化物，甲醇溶解，點樣，采用甲苯：丙酮：冰醋酸=3∶3∶1的體系展開，用三氯化鐵顯色劑顯色，結果見下圖1，從左之右依次為水洗脫、10%乙醇洗脫、30%乙醇洗脫、50%乙醇洗脫、70%乙醇洗脫、95%乙醇洗脫、表兒茶素標準品。見圖1。

圖1薄層圖譜顯示，在樹莓莖葉的大孔樹脂洗脫液中未檢測到原花青素。

2.4.3 提取液TLC鑒別 為了考察樹莓莖葉提取液中原花青素經(jīng)過樹脂的純化是否損失，對上樣液及沉淀物按上述條件進行鑒別，結果見圖2，從左至右依次為上樣液、沉淀物、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇、表兒茶素標準品。見圖2。

圖2薄層圖譜顯示，在樹莓莖葉的提取物中未檢測到原花青素。

2.5 工藝對照試驗 為了驗證樹莓莖葉中原花青素提取、鑒別方法的正確可靠，取含有原花青素的葡萄籽為研究對象進行對照研究。

2.5.1 葡萄籽的提取與分離純化 取新鮮葡萄籽，水洗凈，40℃下鼓風干燥至干，取干燥的葡萄籽，人工研磨粉碎至粗粉；取粗粉加入6倍量的石油醚浸泡6 h脫脂，濾過，棄去濾液；取濾渣，采用和樹莓莖葉同樣的提取和分離方法進行處理[5-6]。

2.5.2 TLC鑒別結果 取大孔樹脂純化物，甲醇溶解，點樣，采用甲苯：丙酮：冰醋酸=3∶3∶1的體系展開，用三氯化鐵顯色劑顯色，結果見下圖3，從左至右依次為葡萄籽上樣液、樹莓莖葉上樣液、30%乙醇樹莓莖葉洗脫液、30%乙醇葡萄籽洗脫液、50%乙醇樹莓莖洗脫液、50%乙醇樹莓葉洗脫液、表兒茶素標準品。見圖3。

按圖3薄層圖譜顯示，在葡萄籽提取液及洗脫液中均檢測到原花青素，而在樹莓莖葉的提取液、大孔樹脂純化物中均未檢測到原花青素。

2.6 文獻記載方法對照 檢索數(shù)據(jù)庫，對樹莓的有關文獻中涉及提取分離的文章進行查閱總結，用以下方法提取。取適量樹莓莖葉粉碎成粗粉，加入5倍量60%的乙醇溶液，浸泡1 h，60℃回流提取2次，每次30 min，合并提取液，靜置，取上清液作為上樣液，分離純化方法不變。

2.6.1 TLC鑒別結果 取大孔樹脂純化物，甲醇溶解，點樣，采用甲苯：丙酮：冰醋酸=3∶3∶1的體系展開，用三氯化鐵顯色劑顯色，結果見下圖4，從左從左至右依次為上樣液、沉淀物、30%乙醇洗脫、50%乙醇洗脫、95%乙醇洗脫、表兒茶素標準品。見圖4。

圖4薄層結果顯示采用文獻記載的提取方法提取也未檢測到原花青素。

3 討論與分析

樹莓中原花青素的提取率與樹莓莖葉的狀況和提取條件密切相關，因莖葉中的含量確實較低，莖葉的貯存、干燥、粉碎度、溫度等都可能導致原花青素化學結構的變化和提取率的變化，本實驗為下一步考察物理環(huán)境對樹莓的影響起到拋磚引玉的效果。

提取溶劑也是影響提取率的關鍵因素。有文獻記載原花青素在植物體內(nèi)通常與蛋白質、多糖等以氫鍵和疏水鍵形式形成穩(wěn)定的分子復合物，原花青素分子間也是如此，因此原花青素的提取劑，不僅要對其有很好的溶解性，而且還必須有氫鍵斷裂作用。因此有機溶劑和水的復合體系最適合提取。

原花青素在中性條件下容易與金屬離子發(fā)生絡合沉淀，沉積在纖維中不利于提取，此時也必須采用酸化溶劑，一方面斷裂原花青素與蛋白質、多糖及本身離子間的氫鍵和疏水鍵，另一方面斷裂原花青素-金屬離子絡合鍵，提高提取率。

4 結論

通過這種方法，未在樹莓莖葉中檢測出來原花青素，主要原因有：樹莓莖葉中原花青素含量較低，沒有提取出來。原花青素在提取純化等加工過程中遭到破壞。方法需進一步改進。本實驗雖然沒有取得一個鮮明的結果，但是在容易被大家忽略的藥材加工廢棄物中摸索尋找一種廢物利用的方法，不失為一種藥材可持續(xù)發(fā)展的思路。

[1]張琦，劉學，孟憲軍，等.樹莓葉的主要功效成分及開發(fā)利用前景[J].中國調(diào)味品，2008，2:26-29.

[2]張立實.花青素與原花青素的生物學作用研究進展[J].全國公共衛(wèi)生與食物營養(yǎng)高層論壇.

[3]韓澤梅，李曉波，張玉平，等.樹莓種子原花青素的提取分離工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18:108-111.

[4]胡靜.玫瑰花總原花青素的分離、純化與分析[D].杭州：浙江大學論文2005.

[5]趙平，宋學娟，張月萍.大孔樹脂對葡萄籽原花青素的吸附研究[J].中國中藥雜志，2007，32（20）:2196-2201.

[6]馬龍，向陽.葡萄籽中原花青素提取工藝的研究[J].新疆醫(yī)科大學學報，2005，28，（3）:215-217.

Branchesand leaves of the raspberry in the extraction of proanthocyanidins Analysis on the Effect of the Extraction and Separation Method of Proanthocyanidins in Stems and Leaves of Raspberry

LIU Lihua1,LI Xuelin1,2
(1.Collegeof Pharmacy,HenanUniversityof TraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China;2.Department of Pharmacy,TheFirst AffiliatedHospitalof HenanUniversityof TraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China)

Objective To analyze the extraction and separation method of the proanthocyanidins in stems and leaves of raspberry.Methods The ethanol solution reflux extraction and macroporous resin separation and purification method were used to extract the active ingredients which were qualitatively analyzed TLC method.Results Through chromogenic reagent of TLC method,the corresponding color was not displayed in the same position in the reference substance.Conclusion This method didn't extract proanthocyanidins in stems and leaves of raspberry.

raspberry;proanthocyanidins;TLC;experimental research;Chemistry of Chinese Materia Medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.22.080

1672-2779（2015）-22-0150-03

*通訊作者：lixuelin450000@163.com

2015-08-31）