熊月路+崔蘊(yùn)慧+曾天駿+巫嘉華+李冬玲+王治平+王一飛

[摘要]目的 建立HPLC法同時(shí)測(cè)定葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒中4種異黃酮類成分的包封率及載藥量。方法 采用RP-HPLC法，Kromasil C18（4.6mm × 250mm， 5μm）色譜柱；甲醇-0.1%枸櫞酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫；流速1.0mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。采用高速離心法分離固體脂質(zhì)納米粒中游離藥物。 結(jié)果 3-羥基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元線性關(guān)系良好，平均回收率分別為（100.28±2.52）%、（100.26±2.33）%、（100.08±3.35）%及（100.44±3.48）%。3批次葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒中3-羥基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元的包封率分別為（84.35±0.45）%、（86.84±0.48）%、（89.52±0.86）%及（93.80±0.50）%，其載藥量分別為（10.37±0.36）%、（14.19±0.52）%、（16.79±0.34）%及（20.00±0.97）%。 結(jié)論 本法簡(jiǎn)單快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可同時(shí)測(cè)定葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒4種成分的載藥量與包封率。

[關(guān)鍵詞]葛根總黃酮；固體脂質(zhì)納米粒；載藥量；包封率

[中圖分類號(hào)]TQ461 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號(hào)]2095-0616（2014）20-54-05

Determination of drug loading and entrapment efficiency of pueraria flavonoids loaded solid lipid nanoparticles by HPLC

XIONG Yuelu1 CUI Yunhui2 ZENG Tianjun1 WU Jiahua1 LI Dongling1

WANG Zhiping1 WANG Yifei3

1. School of Pharmacology， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China； 2. The First Affiliated Hospital of Jinan University， Guangzhou 510632， China； 3. Institute of Biological Medicine， Jinan University， Guangzhou 510632， China

[Abstract]Objective To establish a method for simultaneous determination of drug loading and entrapment efficiency of four isoflavones in pueraria flavonoids （PF）loaded solid lipid nanoparticles（PF-SLN）. Methods HPLC determination was performed on a Kromasil C18 column （4.6mm×250mm， 5 μm） and detected at 250 nm. The mobile phase was consisted of methanol and 0.1% citric acid solution with gradient elution. Flow-rate was 1.0mL/min， and column temperature was 40℃. The free drugs in solid lipid nanoparticles were separated by high-speed centrifuge. Results 3-hydroxypuerarin， puerarin， daidzin and daidzein had a good linear relation and the average recoveries were （100.28±2.52）%， （100.26±2.33）%， （100.08±3.35）% and （100.44±3.48）%， respectively. The entrapment efficiency of 3-hydroxypuerarin， puerarin， daidzin and daidzein in PF-SLNs were （84.35±0.45）%， （86.84±0.48）%，（89.52±0.86）% and （93.80±0.50）%， and drug loading were （10.37±0.36）%， （14.19±0.52）%， （16.79±0.34）% and（20.00±0.97）%， respectively. Conclusion Results obtained showed that its a convenient， accurate and reliable method. The method has been successfully applied to determination of drug loading and entrapment efficiency of four isoflavonoids in PF-SLNs.

[Key words]Pueraria flavonoids； Solid lipid nanoparticles； Drug loading； Entrapment efficiency

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]。葛根總黃酮（Pueraria flavonoids，PF）是葛根的有效部位，具有活血化瘀之功，用于缺血性中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)恢復(fù)期瘀血痹阻脈絡(luò)證?，F(xiàn)代藥理研究表明，PF具有抗血栓形成，抗細(xì)胞凋亡[2]，抗胰腺損傷[3]，抗偏頭痛[4]及抗氧化應(yīng)激[5-6]等作用。PF主要由葛根素（puerarin）、大豆苷元（daidzein），大豆苷（daidzin）、3-羥基葛根素（3-hydroxypuerarin）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）等組成[7]。但PF的水溶性和穩(wěn)定性均較差，其主要有效成分葛根素的生物利用度僅為3.95%[8]，嚴(yán)重制約其臨床應(yīng)用。為提高PF主要有效成分的生物利用度，有學(xué)者研究了固體分散體[9-10]、自微乳滴丸[11]及分散片[12]等，未見葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒的相關(guān)研究報(bào)道。endprint

固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）由生理性脂質(zhì)、表面活性劑和水組成，既具備聚合物納米粒物理穩(wěn)定性高、藥物泄漏少等優(yōu)點(diǎn)，又兼?zhèn)渲|(zhì)體、微乳等低毒性、規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具發(fā)展前景的新型給藥載體系統(tǒng)，而受到各發(fā)達(dá)國(guó)家的廣泛重視。SLN可增強(qiáng)與生物膜的黏附性，延長(zhǎng)胃腸道的黏附時(shí)間和滯留時(shí)間，有效地提高藥物生物利用度[13-14]。

為提高PF溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度，本研究以PF為模型藥物，采用高壓均質(zhì)技術(shù)[15-18]制備葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒（PF-SLN）。載藥量和包封率測(cè)定是制備SLN時(shí)處方篩選與質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。為此，建立了HPLC同時(shí)測(cè)定PF-SLN中4種主要異黃酮類成分（3-羥基葛根素、葛根素、大豆苷及大豆苷元）的方法，為PF-SLN的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根素對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（含測(cè)用，批號(hào) 110752-200511），大豆苷元對(duì)照品購(gòu)自上海同田生物（批號(hào)09020513，純度≥99 %），3-羥基葛根素及大豆苷對(duì)照品由本實(shí)驗(yàn)室自制（熔點(diǎn)、比旋度、UV、MS 及NMR與文獻(xiàn)一致，純度均>95 %）；山崳酸甘油酯（Compritol 888 ATO，批號(hào)135683）；吐溫-80（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20091214）；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純；PF自制[19-21]，UV測(cè)得以葛根素計(jì)的總黃酮含量為62.19 %，HPLC測(cè)得3-羥基葛根素、葛根素、大豆苷及大豆苷元含量分別為1.04%、10.39%、1.46%及0.52%；PF-SLN由本實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)分別為PFN130601，PFN130602，PFN130603。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 高效液相色譜儀（Empower Pro色譜數(shù)據(jù)工作站，996二極管陣列檢測(cè)器，600 四元泵，717plus 自動(dòng)進(jìn)樣器，在線脫氣機(jī)）；高速分散機(jī)（IKA T18 basic.ULTRA-TURRAX？，德國(guó)）；高壓均質(zhì)機(jī)（APV-2000，德國(guó)）；高速離心機(jī)（Sigma 1-13）；電子天平（Sartourius，BP211D）；超純水器（Millipore）。

1.3 方法1.3.1 PF-SLN的制備 采用高壓均質(zhì)法（high pressure homogenization technique，HPH）制備PFSLN。稱取處方量的脂質(zhì)及PF，在（85±2）℃水浴加熱融化，混勻，為脂質(zhì)相；另取處方量的吐溫-80，加適量超純水分散，置同溫水浴中，為水相。在保溫狀態(tài)下，將水相倒入脂質(zhì)相中，攪勻，先高速分散機(jī)4000 r/min分散5min（預(yù)試發(fā)現(xiàn)：低于5min，則需增大高壓均質(zhì)次數(shù)，才能制得合適粒徑的混懸液；而超過(guò)5min，分散形成的泡沫過(guò)多，嚴(yán)重影響后續(xù)操作），得微乳，趁熱用高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)15次（1500bar），即得PF-SLN。

1.3.2 供試溶液制備 （1）供試品溶液：精密吸取PF-SLN 0.5mL，置5mL量瓶中，加入30%乙醇溶液稀釋至刻度，微孔濾膜（0.45μm）過(guò)濾，即得。（2）空白供試品溶液：按處方比例稱取缺PF的脂質(zhì)及表面活性劑，按PF-SLN的制備方法制得空白SLN，精密吸取0.5mL，置5mL量瓶中，加入30%乙醇溶液稀釋至刻度，微孔濾膜（0.45μm）過(guò)濾，即得。（3）對(duì)照品溶液：精密稱取各對(duì)照品適量，分別用甲醇制成每1mL中含3-羥基葛根素0.294mg、葛根素0.721mg、大豆苷 0.317mg、大豆苷元0.219mg的溶液，即得。臨用時(shí)稀釋或制成混合對(duì)照品溶液。

1.3.3 色譜條件 Kromasil 100-5C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，預(yù)柱（Security Guard，C18，4.0mm×3.0mm，Phenomenex）；以甲醇-0.1%枸櫞酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫[17]；流速1.0mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。

1.3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取“1.3.2”項(xiàng)下的空白供試品溶液、供試品溶液及混合對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，分析，即得。

1.3.5 方法學(xué)考察[22]（1）檢測(cè)限及定量限：將各對(duì)照品色譜峰測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，分別以信噪比為 3∶1及 10∶1時(shí)注入儀器的量確定檢測(cè)限和定量限。（2）線性關(guān)系考察：分別精密吸取上述對(duì)照品溶液適量，進(jìn)樣分析，分析結(jié)果以峰面積（Y）對(duì)對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量（X，ng）進(jìn)行回歸。（3）精密度試驗(yàn)：精密吸取各對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀分析，重復(fù) 6次。（4）重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取PF-SLN（批號(hào)PFN130601）0.5mL，6份，按“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣分析。（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)：于 0、1、2、4、8h，分別精密吸取供試品溶液（批號(hào)PFN130601），注入色譜儀分析。（6）加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的PF-SLNA（批號(hào)PFN130601）0.25mL，6份，分別精密加入相當(dāng)量的對(duì)照品溶液，揮干溶劑，同“2.2.1”供試品溶液制備方法處理，測(cè)定。

1.3.6 PF-SLN包封率及載藥量測(cè)定 （1）游離PF（WF）測(cè)定：精密吸取PF-SLN 1.0mL，置離心管中，離心（14 000r/min）30min，吸取上清液，注入色譜儀，分析，即得。（2）PF-SLN總藥量（WT）測(cè)定：精密吸取PF-SLN 0.5mL，置5mL量瓶中，加入30%乙醇溶液稀釋至刻度，微孔濾膜（0.45μm）過(guò)濾，分析，即得。endprint

按公式：包封率=（WT-WF）/WT×100% ，載藥量=（WT-WF）/WS×100%（WS為載體材料及藥物的總量），分別計(jì)算各成分的包封率及載藥量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

由分析結(jié)果可知，3-羥基葛根素、葛根素、大豆苷和染料木苷吸收峰分離良好，脂質(zhì)及表面活性劑對(duì)各成分的測(cè)定無(wú)干擾。見圖1。

2.2 方法學(xué)考察

（1） 檢測(cè)限及定量限：3-羥基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元的檢測(cè)限和定量限分別為9.41～29.40ng、8.65～28.84ng、10.14～34.87ng及7.01～21.90ng。（2）線性關(guān)系：3-羥基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元的回歸方程分別為Y=2889.3X+811 837、Y=4892.7X-429 161、Y=4151.7X-69 893及Y=7807.3X-43 979，線性范圍分別為81.28～406.4ng、670.4～3352ng、136.96～684.8ng及31.04～155.2ng，相關(guān)系數(shù)均大于0.9995。（3）精密度：所得各吸收峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.03%、1.18%、0.97%及1.26%。表明儀器精密度良好。（4）重復(fù)性：所得各成分含量的RSD分別為1.37%、1.09%、0.83% 及1.03%。表明本法重復(fù)性良好。（5）穩(wěn)定性：測(cè)得各成分吸收峰峰面積的RSD分別為1.39%、1.11%、1.06% 及0.93%。表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。（6）加樣回收試驗(yàn)：見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率符合規(guī)定。2.3 包封率及載藥量測(cè)定

3批樣品測(cè)定結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

由分析結(jié)果可知，葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒中4種異黃酮類成分的包封率及載藥量存在一定的差別，依次為大豆苷元>大豆苷>葛根素>3-羥基葛根素。含量相對(duì)較低的3-羥基葛根素、大豆苷元及大豆苷的包封率均超過(guò)80%，尤其是大豆苷元的包封率大于90%，而含量較高的葛根素的包封率并非最高。PF各成分的包封率及載藥量與化合物的極性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即成分的極性越小，其包封率及載藥量越大，而與其含量大小無(wú)關(guān)。

測(cè)定藥物包封率時(shí)供試品溶液處理方法有多種。透析法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉，但較費(fèi)時(shí)；凝膠柱色譜法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，用高濃度醇性洗脫劑分離游離藥物時(shí)易破壞樹脂；高速離心法是在離心力的作用下，使大分子和小分子分離。由于操作準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，樣品不必稀釋，不存在被包封藥物泄漏等的問(wèn)題，可有效分離游離藥物與固體脂質(zhì)納米粒。因此，選用高速離心法制備樣品測(cè)定包封率。

研究表明，該方法操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可同時(shí)測(cè)定PF-SLN中不同成分包封率和載藥量，為新制劑臨床前研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-05-21）endprint