李文靜　劉錦燕　史冊　王影　孫景勇　項(xiàng)明潔（1．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海0005；．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科，上海0000；．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床微生物科，上海0005）

·綜述·

無綠藻分子生物學(xué)鑒定與分型研究新進(jìn)展

李文靜1，2劉錦燕2史冊1，2王影1，2孫景勇3項(xiàng)明潔1，2
（1．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200025；2．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科，上海200020；3．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床微生物科，上海200025）

以基因序列為鑒定基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法以其客觀、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是分子鑒定無綠藻的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該文對(duì)近年來應(yīng)用在無綠藻鑒定和分型方面的實(shí)時(shí)定量PCR（Real?Time Quantitative PCR，RT?PCR）技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single Stranded Conformation Polymophism，SSCP）分析、限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）分析、高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）分析、質(zhì)譜（Mass Spectrometry，MS）分析等分子生物學(xué)新技術(shù)和新方法進(jìn)行綜述。

無綠藻；分子生物學(xué)；PCR；質(zhì)譜

［Chin J Mycol，2015，10（2）：126?128］

無綠藻（Prototheca）是一種單細(xì)胞生物，屬于條件致病性真菌。根據(jù)形態(tài)特征，無綠藻屬分為大型無綠藻（Prototheca stagnora）、中型無綠藻（Pro?totheca zopfii）、小型無綠藻（Prototheca wicker?hamii）、Prototheca ulmea、Prototheca blaschkeae及Prototheca cutis sp．nov．6個(gè)種［1?5］。根據(jù)生化、血清學(xué)、核糖體小亞基（SSU）18S rDNA測序等，中型無綠藻又可以分為基因型1和基因型2［1］。目前認(rèn)為中型無綠藻、小型無綠藻、Prototheca blaschkeae和Protothecacutis與人和動(dòng)物疾病都有關(guān)系［2，6］，其中對(duì)人有致病性以小型最常見［3］，截止到2012年全球已報(bào)道無綠藻病160例［7］。對(duì)動(dòng)物有致病性以中型無綠藻基因型2最常見、毒力最強(qiáng)［8?9］。

目前無綠藻診斷主要依靠真菌學(xué)檢查，但存在著耗時(shí)長、技術(shù)要求高、在鑒定分型至亞種或變種方面還有一定的難度等缺點(diǎn)［10］。而分子生物學(xué)方法快速、敏感且特異，具有較大的臨床應(yīng)用潛力。

1　基因序列同源性分析法

基因序列同源性分析是一種聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)與測序技術(shù)相結(jié)合的方法。2012年Sobukawa等［11］根據(jù)18SrDNA同源性將分離自不同奶牛場的無綠藻菌種鑒定為中型無綠藻基因型2。2013年NoriyukiHirose等［10］首先根據(jù)核糖體大亞基（LSU）rDNA D1／D2區(qū)域同源性從一名皮炎患者那里分離鑒定出小型無綠藻，然后將鑒定出的菌株和參照菌株的核糖體小亞基（SSU）rDNA、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、D1／D2的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ITS片段在不同菌種間差別很大，大小順序是小型無綠藻＞P．blaschkeae＞中型無綠藻＞P．cutis。不同小型無綠藻菌株的rDNA拷貝的ITS具有多態(tài)性，據(jù)此將小型無綠藻分為4個(gè)分支：A、B、C、D。

2　基于PCR的分子指紋圖譜技術(shù)

2．1RT?PCR

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real?Time Quantitative PCR，RT?PCR）技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線等手段對(duì)模板進(jìn)行定量分析的方法。2013年Masanobu Onoza?ki等［12］根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)無綠藻菌株的18S rDNA構(gòu)建特異性引物18PZF1和18PZR1和探針PZP1，再進(jìn)行RT?PCR分析，將28個(gè)參照菌株正確鑒定至種水平，其中12個(gè)中型無綠藻正確鑒定至基因型水平，靈敏度達(dá)到50質(zhì)?？截悾堋Ｔ摲椒梢栽?～4 h內(nèi)快速鑒定臨床分離菌株。

2．2PCR?SSCP

PCR?SSCP，即PCR與單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single Stranded Conformation Polymophism，SSCP）結(jié)合分析。2012年P(guān) Cremonesi等［13］將5種無綠藻參照菌株和50個(gè)臨床分離株18S rDNA基因的兩個(gè)區(qū)域PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析。發(fā)現(xiàn)5種參照菌株產(chǎn)生了5種不同的遷移圖案，遷移速率由快到慢分別是中型無綠藻基因型2＞中型無綠藻基因型1＞P．Ulmea＞P．Blaschkeae＞大型無綠藻。50個(gè)臨床分離菌株的遷移圖案與中型無綠藻基因型2相同，結(jié)果與微生物學(xué)和基因測序的分型結(jié)果完全一致。PCR?SSCP是一種快速、簡單、高度重復(fù)性的技術(shù)，對(duì)于從現(xiàn)場分離菌株中鑒定分型出無綠藻基因型2有重要臨床價(jià)值，還可以鑒定出傳統(tǒng)PCR方法無法鑒定的大型無綠藻和P．Ulmea。

2．3RFLP和PCR?RFLP

限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技術(shù)的基礎(chǔ)是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小以反映DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況。2007年M?ller等［8］利用RFLP技術(shù)成功鑒定出中型無綠藻和P．Blaschkeae，但卻無法區(qū)分無綠藻的其他菌種。而PCR?RFLP技術(shù)，以擴(kuò)增替代了酶切，避免了RFLP繁瑣的DNA酶切、轉(zhuǎn)移、雜交等步驟，對(duì)DNA的量和純度沒有很高的要求，還可簡化圖譜的帶型，易于分析［14］。2010年Tomasz Jagielski等［15］利用此技術(shù)，對(duì)分離自患有乳腺炎奶牛的44個(gè)無綠藻菌株進(jìn)行分型，結(jié)果有43株為中型無綠藻基因型2，1株為P．Blaschkeae，這項(xiàng)結(jié)果與基因型特異性PCR鑒定結(jié)果完全一致。

2．4PCR?HRM

高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）技術(shù)原理是在標(biāo)準(zhǔn)PCR試劑的基礎(chǔ)上加入飽和性熒光染料，擴(kuò)增結(jié)束后運(yùn)行HRM程序，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測升溫過程中熒光強(qiáng)度變化，得出特征性熔解曲線，根據(jù)熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測、區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與基因型［16］。2013年Hideto等［17］利用此技術(shù)正確鑒定了2株參照菌株和8株臨床分離菌株，還發(fā)現(xiàn)中型無綠藻基因型1、中型無綠藻基因型2的50%熒光強(qiáng)度值分別是87．86℃和87．46℃。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，操作簡便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。

3　生物質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜分析法（Mass Spectrometry，MS）利用電場和磁場將化合物形成的離子按質(zhì)荷比的不同進(jìn)行分離，從而進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)的分析，所得結(jié)果用質(zhì)譜圖（亦稱質(zhì)譜）表示。電噴霧電離（Electrospray Ionizsation，ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（Matrix Assisted Laser Desorption Ionizsation，MALDI）是生物質(zhì)譜中最具代表性的離子源，它們的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革，它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得在pmol（10?12mol）甚至fmol（10?15mol）的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能。

3．1ESI?MS

電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比（m／z）降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電行數(shù)算出。2013年王璇［18］等將2株中型無綠藻rRNA的PCR產(chǎn)物用雅培PLEX?ID的通用傳感器平臺(tái)進(jìn)行分析，它可以執(zhí)行自動(dòng)化的PCR后脫鹽，ESI?MS信號(hào)采集，頻譜分析，以及數(shù)據(jù)報(bào)告，結(jié)果PCR／ESI?MS可以準(zhǔn)確地將這2株無綠藻鑒定到種水平。

3．2MALDI?MS

MALDI?MS，即Matrix Assisted Laser Desorption Ionizsation Mass Spectrometry，基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離［19］。MAL?DI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間（Time?of?Flight，TOF）檢測器來檢測，MALDI?TOF質(zhì)譜很適合對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。2009年Von Bergen M等［20］利用MALDI?MS準(zhǔn)確地將無害的和致病性的無綠藻鑒定到種水平，后來6種無綠藻的標(biāo)準(zhǔn)菌株MALDI?TOF MS的參照數(shù)據(jù)庫也被建立，這提供了對(duì)于每種菌株覆蓋了很寬的質(zhì)荷比范圍（2 000～20 000 Da）的可重復(fù)、獨(dú)特的光譜圖，2012年J．Murugaiyan等［21］使用主要光譜庫（main spectra library，MSP）樹狀圖將這種光譜圖的可重復(fù)性進(jìn)一步加強(qiáng)，這種MSP樹狀圖幾乎可以和以18S rDNA序列為基礎(chǔ)的樹狀圖媲美。MALDI?TOF MS為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測試手段，近年來在微生物的鑒定方面已經(jīng)有了很廣泛的應(yīng)用［19］。

4　小　結(jié)

人類無綠藻病盡管并不常見，但由于對(duì)此菌的鑒定特征缺乏足夠的認(rèn)識(shí)，目前無綠藻病的診斷率遠(yuǎn)低于實(shí)際感染率［22］。無綠藻外形像酵母菌，但其治療和預(yù)后卻與酵母菌感染大不相同。在奶牛棚中無綠藻幾乎無處不在，由無綠藻導(dǎo)致的奶牛乳腺炎是一種嚴(yán)重而復(fù)雜的疾病，這給乳制品行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。無綠藻導(dǎo)致的奶牛乳腺炎發(fā)病率近年來逐漸增加，這在全球范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注［17］。因此準(zhǔn)確、快速、高效地鑒定與分型無綠藻對(duì)于流行病學(xué)研究、臨床診斷和治療都具有重要的意義。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和交叉學(xué)科（如物理、化學(xué)、微電子等）的迅速發(fā)展，在無綠藻檢測、鑒定和分型方面新的技術(shù)方法不斷出現(xiàn)并顯示了較好的應(yīng)用前景，如基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析就以其簡便快速、高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高分辨率、低成本等優(yōu)勢成為一種強(qiáng)有力的分析測試手段，有望取代現(xiàn)有的對(duì)于無綠藻的鑒定方法［19］。

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［本文編輯］王飛

New advance in the study of the molecular biological identification and typing of Prototheca

LI Wen?jing1，2，LIU Jin?yan2，SHI Ce1，2，WANG Ying1，2，SUN Jing?yong3，XIANGming?jie1，2
（1．DepartmentofLaboratory，RuijnHospital，ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200025；2．Radioimmunology and Clinical Laboratory，Luwan Branch，Ruijn Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200020；3．Department of Clinical Microbiology Laboratory，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025）

The molecular biology method based on gene sequencing which is objective，highly reproducible and so on，is consid?ered the＂gold standard＂of Prototheca＇s molecular identification．To summarize the new molecular biology methods and techniques applied to Prototheca＇s identification and typing，such as real?time quantitative PCR（RT?PCR）technology，single strand conforma?tion polymorphism（SSCP）analysis，PCR?restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis，high resolution melting（HRM）analysis，mass spectrometry（MS）analysis．

Prototheca；Molecular biology；PCR；MS

R 519．5

A

1673?3827（2015）10?0126?03

李文靜，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：15000028775＠163．com

項(xiàng)明潔，E?mail：mjxiang123456＠126．com

2014?11?28