冬雪

把一種外源性基因轉(zhuǎn)移到另一種原來(lái)并不含這種基因的生物體內(nèi)是基因的拼接和重組，也就是轉(zhuǎn)基因，這種技術(shù)是基因工程的一種形式。目前的轉(zhuǎn)基因主要分為對(duì)植物基因和對(duì)動(dòng)物基因的轉(zhuǎn)移兩大類(lèi)。本文描述的是植物轉(zhuǎn)基因。

轉(zhuǎn)移植物基因的兩種方法

一種或多種外源性基因是如何轉(zhuǎn)入另一種植物（作物）體內(nèi)的呢？可以用一種通俗的比喻來(lái)解釋。

例如，人類(lèi)社會(huì)是由無(wú)數(shù)個(gè)家庭組成的，每個(gè)家庭都有固定的家庭成員，除了血緣的緊密紐帶關(guān)系外，還有經(jīng)濟(jì)和其他的關(guān)系把家庭成員固定在一起，家庭成員不會(huì)輕易分離，同時(shí)一個(gè)家庭也不會(huì)讓陌生人進(jìn)入。一旦有另一名成員進(jìn)入一個(gè)穩(wěn)定的家庭，除非是特別親近的親屬關(guān)系或收養(yǎng)關(guān)系，都會(huì)受到這個(gè)家庭成員的排斥，不可能被這個(gè)家庭接受，所以被稱(chēng)為“第三者”。

一種植物體內(nèi)的染色體（DNA）中的基因也是固定的，輕易不能分開(kāi)和分解，一個(gè)或幾個(gè)外源性基因就是第三者，一般是不會(huì)被一種受體植物所接受的，如果受體植物發(fā)現(xiàn)了外源性基因，就會(huì)用自身的武器，如DNA酶來(lái)降解（殺滅）外來(lái)基因。因此，為了有效轉(zhuǎn)移外源性基因，如將外源性的抗蟲(chóng)基因——蘇云金桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白基因（Bt基因）轉(zhuǎn)移到棉花中，就得采取兩種辦法。一種是載體轉(zhuǎn)移（包裝法或間接法）；另一種是直接轉(zhuǎn)移，或強(qiáng)行轉(zhuǎn)移。

用載體作為媒介進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移就是將目標(biāo)基因連接或包裹于某一載體DNA中，載體通常是微生物，然后通過(guò)載體感染受體植物，將外源性基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。直接轉(zhuǎn)移是利用植物細(xì)胞生物學(xué)特性，通過(guò)物理、化學(xué)和生物學(xué)方法將外源性基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。

所以，前一種方法是包裝法，也是一種蒙蔽或欺騙方法；后一種方法是強(qiáng)硬的，有一點(diǎn)像陌生人或強(qiáng)盜強(qiáng)行闖入別人的家庭，并登堂入室，占據(jù)主要位置，或者說(shuō)反客為主。

載體轉(zhuǎn)移

載體轉(zhuǎn)移又稱(chēng)為農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)移。20世紀(jì)70年代末80年代初，研究人員發(fā)現(xiàn)，野生型Ri（根誘導(dǎo)）和Ti（瘤誘導(dǎo)）質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化煙草和馬鈴薯細(xì)胞獲得再生植株，此后，以Ti質(zhì)粒為載體的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐漸得到應(yīng)用。今天，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法是最主要的一種載體轉(zhuǎn)移方法。利用經(jīng)過(guò)改造的農(nóng)桿菌Ti和Ri質(zhì)粒為載體可以高效地轉(zhuǎn)移外源性基因。

農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，分為根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，它們的細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。根癌農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而產(chǎn)生冠梁瘤，發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)?？梢郧秩倦p子葉植物而產(chǎn)生大量的不定根（或稱(chēng)之為毛狀根）。

無(wú)論是Ti質(zhì)粒還是Ri質(zhì)粒，其上有一段轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA），農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將轉(zhuǎn)移DNA插入到植物基因組中，并且可以通過(guò)減數(shù)分裂穩(wěn)定地遺傳給后代，這就讓農(nóng)桿菌可以把一種或多種外源性基因轉(zhuǎn)移到某種受體植物中。

最初研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量的酚類(lèi)化合物，因而吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，這時(shí)農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)移DNA轉(zhuǎn)移到受傷的植物細(xì)胞（受體細(xì)胞），并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA中。在自然條件下農(nóng)桿菌只是感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。

因此，如果將一段目標(biāo)基因（外源性基因）插入到Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移DNA上，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目標(biāo)基因進(jìn)入受體植物細(xì)胞，并將其插入到受體植物細(xì)胞的染色體中，使目標(biāo)基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)?？瓜x(chóng)的Bt基因就是這樣被轉(zhuǎn)移到棉花或玉米中的。當(dāng)然，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只用于雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)移，但是，近年來(lái)隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因也在一些單子葉植物，尤其是水稻中得到廣泛應(yīng)用。

利用載體對(duì)植物進(jìn)行外源性基因的具體轉(zhuǎn)移過(guò)程如下：

一是獲取目標(biāo)基因，即在目標(biāo)基因被克隆后，用限制性核酸內(nèi)切酶切割下目標(biāo)基因。

二是把目標(biāo)基因與載體相連（構(gòu)建載體），即用DNA連接酶將目標(biāo)基因與載體（大多數(shù)選用質(zhì)粒）連接起來(lái)。

三是將目標(biāo)基因?qū)胼d體細(xì)胞，即把含目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌細(xì)胞。

四是對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)與鑒定，用DNA分子雜交技術(shù)和抗原-抗體雜交技術(shù)進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平鑒定，以確定農(nóng)桿菌細(xì)胞中是否包含目標(biāo)基因。

五是將成功表達(dá)外源性基因的農(nóng)桿菌細(xì)胞導(dǎo)入受體植物（如棉花）內(nèi)，然后再對(duì)受體植物進(jìn)行目標(biāo)基因的生物學(xué)鑒定，如果受體植物中有目標(biāo)基因的表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因獲得成功。

目前，利用農(nóng)桿菌載體進(jìn)行外源性基因的轉(zhuǎn)移是采用得最多的植物轉(zhuǎn)基因方法。當(dāng)然，除了Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒為載體的基因轉(zhuǎn)移外，還可以用脂質(zhì)體為載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。脂質(zhì)體是由磷脂組成的膜狀結(jié)構(gòu)，因此可將目標(biāo)基因包裝在脂質(zhì)體內(nèi)以避免受體植物細(xì)胞中的DNA酶將目標(biāo)基因降解，從而保證目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入到受體植物的細(xì)胞中。

所以，無(wú)論是利用農(nóng)桿菌載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，還是利用脂質(zhì)體為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，都是通過(guò)包裝的方法進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)移，也能避免受體植物中的DNA酶排斥外源性基因。

直接轉(zhuǎn)移

把外源性基因直接轉(zhuǎn)移到另一種植物中也是一種強(qiáng)行轉(zhuǎn)移。這正如陌生人要進(jìn)入一戶(hù)人家，沒(méi)有鑰匙進(jìn)不了門(mén)，沒(méi)有經(jīng)過(guò)主人允許和開(kāi)門(mén)也進(jìn)不了門(mén)。但是，還有一種方法能進(jìn)門(mén)，即強(qiáng)行入門(mén)，強(qiáng)行的方法就包括，撬掉門(mén)鎖、敲碎窗戶(hù)以及翻墻進(jìn)入等。外源性基因的直接轉(zhuǎn)移就是如此。

直接轉(zhuǎn)移一種外源性基因到受體植物中也有多種方法，包括電穿孔法、基因槍法和微注射法（子房注射法）等。

1.電穿孔法

電穿孔法指的是，細(xì)胞在外加高壓電脈沖電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的105～115微米微小通道，這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復(fù)。在此期間生物大分子如基因片段可通過(guò)這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞，因此能把外源性基因轉(zhuǎn)入受體植物體內(nèi)。

現(xiàn)在，這種方法已較廣泛地應(yīng)用于單子葉和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)移，同時(shí)也應(yīng)用于動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移。早在1995年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部研究所就用這種方法把兩種著色劑——錐蟲(chóng)藍(lán)和熒光素二乙酸鹽直接轉(zhuǎn)入到大豆、紫花苜蓿、煙草3種植物的細(xì)胞中，并獲得高水平的基因表達(dá)。到了20世紀(jì)80年代末，研究人員也用電穿孔法將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入玉米自交系的原生質(zhì)體，從而生成植株。此后，抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米和油菜等也相繼問(wèn)世并獲得廣泛種植，方法也是采用電穿孔法。endprint

現(xiàn)在，抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因作物已成為全球播種面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。草甘膦殺死雜草的原理在于競(jìng)爭(zhēng)性抑制植物葉綠體或者質(zhì)體中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），這種酶是多種植物和雜草所共同擁有的。通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法，讓受體作物如棉花、玉米、大豆產(chǎn)生更多的EPSPS，就能抵抗草甘膦，從而讓作物不被草甘膦除草劑殺死。有了這樣的轉(zhuǎn)基因棉花、玉米和大豆，農(nóng)民就不必使用多種除草劑，只需使用草甘膦一種除草劑就能殺死多種雜草。

2.基因槍法

基因槍法又稱(chēng)粒子轟擊技術(shù)，是用粒子槍把表面吸附有外源性基因的金屬微粒高速地射進(jìn)植物細(xì)胞或組織。由于根癌農(nóng)桿菌僅對(duì)某些雙子葉植物敏感，而對(duì)多數(shù)單子葉植物不敏感，從而限制了根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法（農(nóng)桿菌載體）轉(zhuǎn)移基因。但基因槍法不受宿主限制，宿主既可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，它們也即受體植物。

基因槍法可控度高，同時(shí)不需要去除受體植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織容易再生成植株?；驑屴Z擊過(guò)程中可根據(jù)需要將射彈射入特定層次（位置）的細(xì)胞，有利于提高轉(zhuǎn)化效率?；驑尫ú僮骱?jiǎn)單、迅速，但費(fèi)用較高。基因槍法主要用于轉(zhuǎn)移植物基因，也可用于對(duì)動(dòng)物、微生物等的基因轉(zhuǎn)移。

現(xiàn)在利用基因槍法轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因園藝植物較少，只有楊樹(shù)、云杉等，而獲得的轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、煙草、大豆、木薯等作物較多?；驑尫ìF(xiàn)在還存在轉(zhuǎn)化效率低、外源性基因向植物中插入不夠精確和穩(wěn)定性不高等缺點(diǎn)。

3.子房注射法

子房注射法也稱(chēng)微注射法。子房是被子植物生長(zhǎng)種子的器官，位于花的雌蕊下面，一般略為膨大。子房里面有胚珠，胚珠受精后可以發(fā)育為種子。子房由子房壁和胚珠組成。當(dāng)傳粉受精后，子房發(fā)育成果實(shí)。子房壁最后發(fā)育成果皮，包裹種子，有的種類(lèi)形成果肉，如桃、蘋(píng)果等。

子房注射法就是使用微注射針或顯微注射儀將外源性基因注入處于減數(shù)分裂期的受體植物的子房中，借助子房產(chǎn)生的壓力和卵細(xì)胞產(chǎn)生的吸收力，外源性基因可進(jìn)入受精的卵細(xì)胞中，借助合子胚旺盛分裂過(guò)程中基因組的復(fù)制、重組、缺失或易位等現(xiàn)象，外源性基因被隨機(jī)整合到受體作物的染色體上。

20世紀(jì)90年代，一些Bt轉(zhuǎn)基因玉米就是用子房注射法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的，這種轉(zhuǎn)基因玉米可以抗御玉米螟的啃食。目前，子房注射法成功用于玉米、甜瓜和黃瓜等農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因育種。

子房注射法的步驟是，制備目標(biāo)基因；根據(jù)受體植物受精后其子房的變化特點(diǎn)，確定最佳時(shí)間進(jìn)行外源性基因注射或?qū)㈦x體的受精子房進(jìn)行外源性基因注射，再對(duì)該離體子房進(jìn)行培養(yǎng)；轉(zhuǎn)化種子及對(duì)后代的外源性基因和其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分子檢測(cè)。

子房注射法無(wú)需組織培養(yǎng)過(guò)程，操作過(guò)程簡(jiǎn)單、便捷，但田間轉(zhuǎn)化過(guò)程的工作量大。轉(zhuǎn)化過(guò)程中，子房受到機(jī)械性傷害易導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率和結(jié)實(shí)率低；易產(chǎn)生基因污染，而且該方法只能在授粉期進(jìn)行，容易受季節(jié)和天氣等自然條件影響。由于后代群體規(guī)模較大，篩選過(guò)程工作量較大。

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