王賀寧，孟祥溪，周克迪，任秋實，孫紅芳北京大學 工學院生物醫(yī)學工程系，北京 100081

分子影像探針—量子點在癌癥成像和早期檢測中的應用

王賀寧，孟祥溪，周克迪，任秋實，孫紅芳
北京大學 工學院生物醫(yī)學工程系，北京 100081

1 研究背景

根據世界衛(wèi)生組織于2014年2月4日世界癌癥日發(fā)布的2014年《世界癌癥報告》[1]，癌癥已經成為全世界人類的最大致死原因，而中國的癌癥發(fā)病率已經居于世界首位。隨著環(huán)境污染，食品安全等各種問題的涌現，人類健康受到很多來自外部環(huán)境的威脅，無疑加劇了各種癌癥發(fā)生的可能。因此如果能實現癌癥的早期診斷和個性化的診療是非常重要的，可以大大降低癌癥的死亡率，同時也提高病人的生存質量。生物醫(yī)學成像技術在癌癥的各個臨床階段中正在發(fā)揮越來越重要的作用，包括癌癥預測、篩選、指導活檢、癌癥的分期、轉移、預后、治療計劃和復發(fā)等各個階段[2]。目前采用的癌癥成像技術有無創(chuàng)的X射線斷層掃描（CT），磁共振成像（MRI），超聲（US）、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、單光子發(fā)射斷層顯像（SPECT）和光學成像（Optical imaging）等多種影像手段進行檢測。然而，這些成像技術大多數不能用于微觀層面上的檢測。

與此同時，隨著納米技術的快速發(fā)展，越來越多的研究工作者開始利用納米顆粒作為多模態(tài)分子影像探針的載體。以納米材料作為多模態(tài)分子影像探針的載體具有下述幾方面的優(yōu)點：① 高的比表面積，可以同時裝載生物靶向分子和影像探針分子；② 通過負載于納米顆粒，可以有效改善生物靶向性分子的體內穩(wěn)定性和探針分子的藥代動力學；③ 適宜的尺寸，可以利用腫瘤組織的高通透性和滯留效應（EPR效應）被動靶向腫瘤，提高影像探針的利用率。目前人們已將現有的光學成像技術與先進的納米粒子為基礎的光學對比劑相結合，實現了高分辨率的活體腫瘤成像。其中，可發(fā)射熒光的光學納米顆?！孔狱c，已經應用于多種生物醫(yī)學成像研究中。本文將主要介紹量子點在癌癥成像和早期檢測中的應用。

2 量子點的定義以及在成像方面的優(yōu)勢

量子點（Quantum Dots, QDs）是一類由II/VI族或III/ V族元素組成的，直徑為2～10 nm，能夠接受激光激發(fā)產生熒光的半導體納米微晶體，具有納米顆粒典型的量子效應和獨特的光學特性。與傳統(tǒng)的有機染料和熒光蛋白相比，量子點具有熒光強度高，不容易淬滅的特點；此外，其發(fā)射的熒光波長可以通過量子點的尺寸，化學組成和晶格結構改變，能夠在可見光和紅外區(qū)的大范圍波段進行調制，因此，量子點在生物成像領域有著很多的應用，并且被廣泛應用于癌癥成像和早期診斷[3]。

3 量子點在癌癥成像和檢測方面的應用

3.1 細胞成像的應用

研究人員應用量子點在體外檢測，標記固定的細胞和組織標本，以及活細胞成像等方面做了很多工作。通過將量子點進行不同類型的功能化，如耦合鏈霉親和素，抗體，受體配體如表皮生長因子（EGF）或血清素，識別肽等，可以將量子點靶向標記到細胞表面的蛋白。比如，在很多乳腺癌中都有高表達的HER2受體，將HER2受體的抗體加入已固定的乳腺癌細胞SK-BR-3，就可以用連接了免疫球蛋白IgG抗體的量子點進行成像。也可以將量子點標記在鏈霉親和素上，可以靶向結合了生物素的一抗，對乳腺癌細胞進行成像[4]。王賀寧等在量子點表面耦合了透明質酸，通過透明質酸和CD44受體的靶向作用，實現了對CD44受體高表達的乳腺癌細胞MD-MB-231和MCF-7的特異性成像[5]。

除了對固定細胞的成像，量子點的長時間穩(wěn)定性和高熒光效率，也使得量子點在活細胞成像方面有很大的優(yōu)勢。阮剛等人使用Tat肽結合的量子點（TAT-量子點）來進行活細胞成像，觀察了活細胞攝取納米顆粒以及在細胞內的轉運。實驗結果表明，該肽偶聯的量子點通過巨吞噬作用內化。Tat-量子點首先束縛到囊泡的內表面上，繼而被細胞器捕獲。此外，他們還發(fā)現，TAT-量子點可以與細胞膜上的結構，例如絲狀偽足結合，而且包含QD的囊泡能夠從絲狀偽足的前端夾斷。這些結果不僅為Tat肽介導的傳送機制提供了新的解釋，也可用于納米粒子探針作為細胞內靶向和成像的發(fā)展[6]。

3.2 早期癌癥檢測

除了用于細胞成像，生物偶聯的量子點也用于靶向標記生物組織樣本，進行生物標志物的成像。特別是在免疫組織化學中使用的多色量子點探針，是臨床上非常重要的應用。將4種不同顏色波長的量子點（565，605，655和705 nm）分別與4種不同的骨轉移行為的腫瘤標志物N-鈣粘蛋白，EF（延伸因子）-1，E-鈣粘蛋白和波形蛋白進行耦合，可以對FFPE前列腺癌的病理組織切片進行多色染色。用圖像處理軟件分析CCD采集到的圖像，通過分析不同顏色量子點的熒光強度，就可以得到對應的病理切片中不同的腫瘤標記物濃度[7]。

3.3 在體成像

腫瘤的在體成像面臨著很大的挑戰(zhàn)，需要敏感性好，特異性高的探針分子。目前的成像機制一方面是造影劑的被動靶向，即利用腫瘤誘導生成的血管通常結構都不穩(wěn)定，并且有很大的內皮空隙。這些空隙可以允許大分子通過（≤400 nm），并且由于缺乏有效的淋巴引流，這些大分子可以在腫瘤的微環(huán)境聚集。這種增強的滲透保留效應，也叫EPR效應，使得納米顆粒和納米治療劑在腫瘤成像中發(fā)揮了很多的作用。

另一方面，癌細胞表面表達的一些特異性的生物分子，如表面受體等，可以用做探針分子主動靶向的分子靶標。在成像探針的研究中，癌抗原（分子成像）的主動靶向在醫(yī)學領域有了很多的發(fā)展，可以用來檢測早期癌癥及其轉移。由于量子點具有很強的熒光信號，并且可以偶聯多個分子，可以與多種抗原進行高敏感性和特異性的癌癥成像。

2002年Akerman等人最早開展了這方面的工作。 他們將量子點與腫瘤細胞和腫瘤血管的親和性肽進行偶聯，通過靜脈將這些探針注射進入負載乳腺癌腫瘤的小鼠后，組織切片的顯微熒光成像表明量子點可以特異性標記宿主的腫瘤血管系統(tǒng)[8]。之后Gao等人將量子點靶向腫瘤，進行了動物全身尺度的成像。通過將量子點與針對前列腺特異性膜抗原（PSMA）的抗體偶聯，靜脈注射到荷人類前列腺癌的小鼠皮下，成像結果顯示注射了主動靶向量子點的的腫瘤熒光比注射非靶向量子點的熒光信號顯著增強[9]。用同樣的方法，Yu等人將甲胎蛋白抗體偶聯至量子點，能夠主動靶向小鼠的肝癌模型[10]。Cai等則采用量子點標記了整合素靶向肽RGD，顯著增強了人腦膠質瘤腫瘤對量子點的攝取[11]。

細胞毒性和量子點在標記細胞過程中對細胞和動物體潛在的干擾是目前量子點的應用過程中的主要問題。目前最常使用的量子點的化學成分中含鎘等有毒重金屬原子[12]，而二價鎘是有腎毒性的，因此利用量子點進行活細胞和動物的成像具有很大的爭議。雖然這些重金屬元素被摻入到量子點的核里，外層包裹了生物惰性的硫化鋅和穩(wěn)定的聚合物，但這些在臨床上使用作為造影劑是否安全，還需要進一步的考察。由于發(fā)表的文章中用了多種不同的合成，增溶和功能化的方法，因此量子點的毒性問題比較復雜。很多文獻當中并沒有發(fā)現量子點在使用的濃度和實驗過程中對細胞活力、形態(tài)、功能或發(fā)育不良的影響（從數小時至數天）。然而也有一些研究工作在較高濃度時，觀測到了對胚胎發(fā)育的影響[13]。因此，量子點并不能說是完全無害的，但應該存在一個安全劑量范圍，使得量子點的應用過程中不影響生物體活性?，F在有很多工作通過改變量子點的成分，合成出了不含鎘等有毒重金屬的量子點，如Ag2S，CuInS2量子點等，大大降低了量子點的毒性，生物相容性有了很大的提高。

4 未來趨勢

在臨床應用中，往往需要對多個診斷指標的聯合分析，才能夠對疾病進行比較精確的診斷。而單一模態(tài)無法提供病灶的全面信息，若單獨進行各個模態(tài)的成像則需要對患者分別注射影像制劑，進行多次成像，對患者將是一系列的痛苦。如果能有一體化的多模態(tài)的分子影像探針，僅需注射一次影像制劑，就可在多模態(tài)的成像儀器上一次性得到多個模態(tài)的影像結果，充分發(fā)揮不同成像模態(tài)的優(yōu)勢，獲得全方位的更精確的疾病信息。這將大大減少患者的痛苦，對醫(yī)生也省去了很多工作。因此發(fā)展一體化的多模態(tài)探針是分子影像探針領域的一個新趨勢。

近年來，已經陸續(xù)有一些結合了不同成像模態(tài)的分子影像探針被報道。例如2010年，Kimura等人將Cy5.5近紅外染料和64Cu-DOTA共價連接到Knotiin Peptide上，實現了整合素的特異性標記和小鼠的全身成像[14]。Ting等人將18F和近紅外染料結合到Lymphoseek 即DTPA修飾的右旋糖苷上，實現了受體特異性的前哨淋巴結（SLN）的成像[15]。將耦合血卟啉的組氨酸螯合99Tcm則可做成熒光／同位素雙模態(tài)探針的活體成像[16]。

與小的有機熒光分子比較，量子點具有大表面積，因此可以通過多功能的化學修飾來做成雙模態(tài)或多模態(tài)的探針。比如將量子點與其他成像劑（例如，放射性核素或順磁性探針）和治療劑（例如，抗癌藥物），通過化學連接或通過簡單的物理方法連接，從而可以得到多功能納米結構，實現多模態(tài)成像和成像治療一體化。目前利用量子點制備的雙模態(tài)探針已有報道。2007年，Schipper等人用64Cu標記800 nm和625 nm波長的氨基-PEG商業(yè)化的量子點，量化地研究了量子點在小鼠體內的全身性的分布，實現了PET和熒光的雙模態(tài)成像[17]。2008年，Ducongé等人將18F標記在磷脂膠束的量子點表面，實現小鼠全身的雙模態(tài)成像[18]。這兩個工作作為將PET同位素和量子點結合的雙模態(tài)探針最早的嘗試，提供了雙模態(tài)在體成像的可能。也有研究者將InP/ ZnS量子點作為核，外圍連接MRI分子探針Gd，做成MRI／熒光量子點雙模態(tài)探針，細胞穿透肽的連接則促進了納米顆粒進入細胞進行雙模態(tài)成像[19]。Farokhzad等人報道了將量子點，核酸適體，和小分子抗癌藥物阿霉素（DOX）結合的的三元體系，實現了在體外的靶向成像，治療和傳感藥物的釋放[20]，從而使量子點可以作為成像治療一體化的探針。

此外，由于傳統(tǒng)量子點含有有毒重金屬成分，因此發(fā)展新型的低毒性量子點也是未來的趨勢。王強斌課題組合成了量子產率更高、生物相容性更好、尺寸均勻可控的Ag2S近紅外量子點，細胞成像實驗結果表明，通過在量子點表面修飾不同的特異性生物分子，可實現對不同細胞系進行特異性標記。通過系統(tǒng)的細胞生物安全性評價，包括細胞增殖、壞死和凋亡、活性氧和DNA損傷實驗等結果表明，Ag2S近紅外量子點幾乎沒有細胞毒性[21]。此外，高明遠等人合成出了CuInS2等量子點，也提高了量子點的生物相容性。同時還合成出了摻Mn的量子點，從而可以進行MRI和熒光的雙模態(tài)成像，實現了低毒量子點的雙模態(tài)成像應用[22]。

5 總結

作為一種新型的熒光探針，量子點已經在生物醫(yī)學成像和癌癥檢測的領域有了很多的應用。量子點不會取代傳統(tǒng)的熒光分子或熒光蛋白融合技術，但量子點的多種優(yōu)良特性比如更好的耐光性，近紅外區(qū)域的光譜，以及長時間的單分子靈敏度，將很好地補充傳統(tǒng)熒光技術的不足。量子點技術的發(fā)展，將可以大大地提高生物成像和檢測的能力。

致謝

該項目由國家重大科學儀器專項（2011YQ030114）,國家基礎研究計劃973項目（2011CB707500）, 國家自然科學基金 （11104058）, 和河北省自然科學基金 （A2011201155）支持。

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A Novel Molecular Imaging Probe: Application of Quantum Dots in Cancer Imaging &Early Diagnosis

WANG He-ning, MENG Xiang-xi, ZHOU Ke-di, REN Qiu-shi, SUN Hong-fang
Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University, Beijing 100081, China

半導體量子點（QDs）是一類可發(fā)熒光的納米粒子，由于其獨特的光學和電子特性，已被廣泛用于生物醫(yī)學成像。與傳統(tǒng)的有機染料和熒光蛋白相比，它們的發(fā)射光譜可隨尺寸大小調節(jié)，有很強的信號亮度，且可抵抗光漂白效應，并且可以同時激發(fā)多種顏色的熒光。當與靶向配體，如抗體，多肽或小分子偶聯時，量子點可被用于靶向腫瘤標志物和腫瘤血管系統(tǒng)，具有很高的親和力和特異性。本文主要綜述了量子點在癌癥成像方面的應用，同時也討論了量子點應用于臨床的局限性，并對其未來應用進行了一些展望。

量子點；癌癥成像；分子影像探針

Semiconductor quantum dots (QDs) are tiny light-emitting particles on the nano-meter scale, and have been widely used for bio-medical applications due to their unique optical and electronic properties. Compared with traditional organic dyes and fluorescent proteins, they have size-tunable light emission, superior signal brightness, photo-bleaching resistance, and broad absorption spectra for simultaneous excitation of multiple fluorescence colors. When conjugated with targeting ligands such as antibodies, peptides or small molecules, QDs can be used to target tumor bio-markers as well as tumor vasculatures with high affinity and specificity. This paper summarizes some of the applications of QDs for cancer diagnosis and imaging. And it also discusses the restrictions for clinical applications and gives some perspectives for the future applications of QDs.

quantum dots; tumor imaging; molecular imaging probe

R197.39

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2015.04.002

1674-1633(2015)04-0007-04

2015-03-02

國家重大科學儀器專項（2011YQ030114），國家基礎研究計劃973項目（2011CB707500），國家自然科學基金（11104058），河北省自然科學基金（A2011201155）。

孫紅芳，工程師。

通訊作者郵箱：shf@pku．edu．cn