劉秀俠，穆熙軍，趙效南，王 鑫，孫學(xué)森，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

植酸對枯草芽孢桿菌及其噬菌體的作用研究

劉秀俠，穆熙軍，趙效南，王 鑫，孫學(xué)森，谷 巍*

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的植酸，探究了植酸對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)0085和0090菌體生長、芽孢形成的影響及對枯草芽孢桿菌噬菌體P85和P90的抑制效果。結(jié)果表明，添加0.150%植酸對其噬菌體P85和P90有明顯抑制效果，但影響芽孢的形成；添加0.070%植酸既可以在一定程度上抑制噬菌體P85和P90又不會影響枯草芽孢桿菌及芽孢的生長。

植酸；枯草芽孢桿菌；噬菌體；抑制

植酸具有強螯合能力和抗氧化能力，廣泛存在于植物種子、果殼和胚芽中，是一種天然存在的含磷有機化合物。植酸在食品、醫(yī)療、化工、冶金和環(huán)保等領(lǐng)域有廣泛的用途[1]。田小海[2]經(jīng)毒理實驗研究發(fā)現(xiàn)，植酸可以提高小鼠的免疫力。植酸具有抗癌[3]、降血糖、預(yù)防大鼠心肌梗塞[4]等作用。作為一種非離子表面活性劑，植酸可加快營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，促進發(fā)酵菌體的生長。丁筑紅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，添加植酸可縮短酵母菌的發(fā)酵周期，促進酵母菌的增殖。作為金屬離子的螯合劑，植酸對鈣、鎂及微量元素鋅、鐵等均有螯合影響[6]。彭益強等[7]通過抑菌實驗研究發(fā)現(xiàn)，植酸對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的最小抑制濃度分別為1.0%、0.5%、0.5%和0.125%，說明枯草芽孢桿菌對植酸溶液較不敏感。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是廣泛分布于土壤、水和空氣等各種不同環(huán)境中產(chǎn)芽孢好氧型革蘭氏陽性細菌[8]，1999年我國農(nóng)業(yè)部正式批準使用其作為益生菌?？莶菅挎邨U菌是飼料添加劑上常用的飼用微生物，攝入機體后可提高動物免疫力[9]、消化酶活性、日增重，顯著降低糞便中的大腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的數(shù)量[10]，提高生產(chǎn)性能[11]等?？莶菅挎邨U菌在食品安全（如降解農(nóng)業(yè)殺蟲劑[12]）、環(huán)境保護（如降解石油[13]）等方面表現(xiàn)出較好的作用效果?？莶菅挎邨U菌對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求簡單，可直接利用低成本的菜籽粕作為氮源[14]。

在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中噬菌體的感染現(xiàn)象非常普遍，UMENE K等[15]從納豆生產(chǎn)工廠分離得到侵染枯草芽孢桿菌發(fā)酵導(dǎo)致發(fā)酵中斷的PM1噬菌體。針對微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中存在的噬菌體污染難題，國內(nèi)外多采用如氧化劑和季銨化合物等化學(xué)消毒劑對噬菌體污染的工業(yè)廠房和研究實驗室進行環(huán)境消毒[16]、膜過濾或紫外光照射與熱處理結(jié)合處理噬菌體污染的發(fā)酵液[17]及檸檬酸鹽或磷酸鹽[18]等金屬離子螯合劑抑制噬菌體等方法[19]。噬菌體侵染宿主菌的過程中需要金屬離子[20]，而植酸具有強螯合金屬離子的性能。本文研究了植酸對枯草芽孢桿菌菌體生長、芽孢形成的影響及對噬菌體的抑制效果，通過分光光度計分別測培養(yǎng)5 h和21 h菌液的OD600nm值，用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，研究植酸在抑制枯草芽孢桿菌噬菌體方面的可實用性，為應(yīng)用植酸提高枯草芽孢桿菌及其他工業(yè)微生物抗噬菌體特性提供了一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）0085及0090：山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院；枯草芽孢桿菌噬菌體P85和P90：山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院基因工程研究室。

氫氧化鈉（分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸膏：天津市英博生化試劑有限公司；瓊脂：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；植酸：美國Aladdin公司。

枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：1%氯化鈉、1%蛋白胨、0.5%酵母浸膏、0.2%葡萄糖，調(diào)pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C恒溫振蕩器：蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S22PC型可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-196TMPI冰箱：青島海爾股份有限公司；JJ300型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 方法

挑取斜面保存的枯草芽孢桿菌至10 mL液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培養(yǎng)16 h，以2%比例轉(zhuǎn)接至數(shù)支新的10 mL液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培養(yǎng)5 h，隨機分配到數(shù)個處理組，每組3個平行，37℃繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)至21 h，用分光光度計在波長600 nm條件下測定菌液的OD600nm值，試驗結(jié)束后對植酸的抑菌效果進行單因素方差分析。對試驗結(jié)果OD600nm值采用SPSS 16.0軟件中的Duncan新復(fù)極差檢驗法進行單因素方差分析，對差異顯著的數(shù)據(jù)進行多重比較。P＜0.05表示有顯著性差異，數(shù)值以“平均值±標準差”來表示。

植酸的處理方法：用超純水將植酸的濃度由50%稀釋至10%，0.22 μm濾膜過濾除菌，4℃冰箱保藏待用；在培養(yǎng)0、5 h及15 h的10 mL枯草芽孢桿菌菌液中，添加10%植酸70 μL、150 μL，使植酸的終濃度分別為0.070%、0.150%。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌鏡檢及活菌計數(shù)

枯草芽孢桿菌0085和0090在10 mL液體培養(yǎng)基中37℃搖瓶培養(yǎng)5 h、21 h，油鏡鏡檢結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，培養(yǎng)5h的枯草芽孢桿菌0085和0090均為桿狀菌體（見圖1A及圖1D）；培養(yǎng)21 h的枯草芽孢桿菌0085和0090多數(shù)形成芽孢（見圖1B及圖1E）；延長培養(yǎng)時間芽孢會脫落（見圖1C及圖1F）。取1mL枯草芽孢桿菌0085和0090菌液活菌計數(shù)，由計數(shù)結(jié)果可知，培養(yǎng)5h的活菌數(shù)分別為1.87×108CFU/mL和1.92×108CFU/mL；培養(yǎng)21h活菌數(shù)分別為9.33×108CFU/mL和9.45×108CFU/mL。因此，枯草芽孢桿菌0085和0090在10 mL液體培養(yǎng)基中37℃搖瓶培養(yǎng)5 h活菌數(shù)已達到將近2×108CFU/mL；培養(yǎng)21 h活菌數(shù)可達到將近109CFU/mL，此時基本全部形成芽孢。結(jié)合公司發(fā)酵生產(chǎn)的實際情況，考慮到這兩個時間點具有代表意義。因此，本研究選擇培養(yǎng)5 h及21 h取菌液測OD600nm值。

2.2 植酸（0.025%～0.200%）對枯草芽孢桿菌及其噬菌體的影響

向培養(yǎng)0、5 h的枯草芽孢桿菌0085和0090中分別添加噬菌體P85和P90（終效價均為107pfu/mL），同時添加過濾除菌植酸（終濃度為0.025%～0.200%），37℃搖瓶培養(yǎng)至21 h，測OD600nm值，結(jié)果見表1。由表1可知，在培養(yǎng)5 h的枯草芽孢桿菌0085和0090中加入終濃度為0.100%～0.200%的植酸后，搖瓶培養(yǎng)至21 h對菌株的生長均有影響，其中對0085菌株無顯著影響（P＞0.05），對0090菌株有顯著影響（P＜0.05）；0.050%～0.200%的植酸對噬菌體P85和P90的抑制作用均達到顯著程度（P＜0.05），其中添加終濃度為0.150%植酸對噬菌體P85和P90的抑制作用最好。因此，當枯草芽孢桿菌0085和0090菌液在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)噬菌體P85和P90污染時，可以考慮添加終濃度為0.15%植酸抑制噬菌體P85和P90。

植酸具有與金屬螯合的24個氧原子、12個羥基和6個磷酸基，可與Ca2+、Mg2+、Fe2+和蛋白質(zhì)結(jié)合[20]。作為一種少見的金屬多齒螯合劑，植酸會影響枯草芽孢桿菌的正常生長。由表1可知，在轉(zhuǎn)接菌液的同時添加0.100%～0.200%植酸對枯草芽孢桿菌0085和0090菌株的生長均有顯著抑制作用（P＜0.05）；接菌的同時添加0.025%和0.050%植酸對培養(yǎng)5 h和21 h的枯草芽孢桿菌0085和0090均無抑制作用，OD600nm值與對照菌液相比差異顯著（P＜0.05），對噬菌體的抑制作用也達到顯著程度（P＜0.05），但是OD600nm值較小，活菌數(shù)達不到實際生產(chǎn)的需要。因此，接菌的同時添加＞0.100%濃度的植酸會影響枯草芽孢桿菌的生長，添加＜0.100%濃度的植酸不能很好的抑制噬菌體侵染宿主菌，植酸適宜濃度需要進一步試驗確定。

2.3 植酸（0.050%～0.100%）對枯草芽孢桿菌及其噬菌體的影響

選擇0.050%～0.100%植酸，目的是尋找對宿主菌的生長無抑制作用，同時對噬菌體的生長有較好的抑制作用的植酸濃度。在轉(zhuǎn)接枯草芽孢桿菌0085和0090至10 mL液體培養(yǎng)基的同時添加終濃度分別為0.050%～0.100%的植酸，培養(yǎng)5 h分別添加噬菌體P85（終效價為107pfu/mL），37℃搖瓶培養(yǎng)至21 h，在5 h及21 h時分別取菌液測OD600nm值，結(jié)果見表2。由表2可知，添加0.050%～0.070%植酸組培養(yǎng)至21h菌液的OD600nm值稍高于對照，且差異顯著（P＜0.05），姚露燕等[21]研究表明，金屬離子濃度大小會影響枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)和芽孢率，推測可能低濃度的植酸螯合一定金屬離子后反而更有利于枯草芽孢桿菌的生長；0.080%～0.100%植酸對枯草芽孢桿菌0085菌株的生長有顯著抑制影響（P＜0.05）；0.07%植酸對效價為107pfu/mL的P85噬菌體有一定的抑制作用。因此，在噬菌體侵染不是特別嚴重的情況下，添加0.07%過濾除菌的植酸既不會影響枯草芽孢桿菌的生長，又能在一定程度上抑制噬菌體侵染宿主菌。

2.4 0.150%的植酸對枯草芽孢桿菌芽孢形成的影響

在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，常會出現(xiàn)芽孢桿菌形成芽孢前后突然出現(xiàn)其噬菌體感染，從而導(dǎo)致發(fā)酵菌體變稀甚至菌體全無的現(xiàn)象，造成時間及資源的浪費。因此，本研究在枯草芽孢桿菌0085和0090形成芽孢前（約15 h）添加植酸與其噬菌體，檢測植酸是否會影響芽孢的形成。由表1可知，0.150%植酸可以很好的抑制枯草芽孢桿菌噬菌體P85和P90侵染裂解宿主菌。在枯草芽孢桿菌0085和0090培養(yǎng)至15 h時添加濃度為0.150%的植酸和終效價為107pfu/mL的噬菌體P85和P90，油鏡鏡檢如圖2所示。由圖2可知，在噬菌體和0.15%植酸存在時，枯草芽孢桿菌0085和0090菌株在21 h基本全為桿狀菌體（見圖2A及圖2C），不能形成芽孢；當延長培養(yǎng)時間至35 h時仍然無芽孢形成（見圖2B及圖2D），而對照菌株在21h已基本全是芽孢（見圖1B及圖1E）。由此可知，0.150%植酸雖然能抑制噬菌體P85和P90侵染枯草芽孢桿菌0085和0090，但是也會影響菌株形成芽孢。

3 結(jié)論

本實驗開展了植酸對枯草芽孢桿菌及其噬菌體的影響研究。不同濃度的植酸（0.050%～0.200%）對枯草芽孢桿菌噬菌體均有一定的抑制作用，其中接菌的同時添加0.070%植酸對宿主菌的生長幾乎無影響，對噬菌體有一定的抑制作用；菌液培養(yǎng)5 h及15 h時添加0.150%植酸在抑制枯草芽孢桿菌噬菌體P85和P90方面作用明顯；菌液培養(yǎng)15 h時添加0.150%植酸會影響芽孢的形成?？傊?，在枯草芽孢桿菌出現(xiàn)噬菌體侵染時，添加0.070%植酸既可以在一定程度上抑制噬菌體又不會影響枯草芽孢桿菌及芽孢的生長；發(fā)酵培養(yǎng)中期及后期，在以獲得菌體、菌體分泌表達產(chǎn)物等不以獲得芽孢為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中可以使用0.150%植酸作為枯草芽孢桿菌的噬菌體抑制劑。

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Effect of phytic acid onBacillus subtilisand phages

LIU Xiuxia,MU Xijun,ZHAO Xiaonan,WANG Xin,SUN Xuesen,GU Wei*
(Shandong Baolai-Leelai Bio-Industrial Group,Tai'an 271000,China)

The effect of different concentrations of phytic acid in the medium onBacillus subtilis0085 and 0090 growth,sporulation and inhibiton on B.subtilisphages was investigated.The results showed that adding phytic acid 0.150%had significant inhibitory impact onB.subtilisphages P85 and P90,and affected the formation of spores,adding phytic acid 0.070%had a certain inhibition impact onBacillus subtilisphages P85 and P90, but not affect the growth ofB.subtilisand spore.

phytic acid;Bacillus subtilis;phages;inhibition

Q939.97

A

0254-5071（2015）06-023-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.027

2015-06-03

國家“863計劃”（2003AA241121002）；國家自然科學(xué)基金（30200199）

劉秀俠（1988-），女，實驗員，碩士，研究方向為芽孢桿菌噬菌體抑制劑及消毒劑的篩選。

*通訊作者：谷巍（1980-），男，高級獸醫(yī)師，碩士，研究方向為獸醫(yī)微生物及免疫學(xué)。