史文姝，金一（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

受精后精子線粒體的命運(yùn)與泛素-蛋白酶體通路間的關(guān)系

史文姝，金一?
（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

在大多數(shù)哺乳動物中，受精的過程涉及到精子與卵子細(xì)胞融合的過程。雖然當(dāng)精子與卵子結(jié)合時(shí)精子中含有線粒體，但是父本的線粒體基因組不會遺傳給后代，因此，在大多數(shù)動物中線粒體遺傳是母性遺傳的。精子線粒體在進(jìn)入卵母細(xì)胞前被泛素標(biāo)記，進(jìn)入卵母細(xì)胞后被卵母細(xì)胞自身的蛋白酶體降解，受精時(shí)僅存在卵母細(xì)胞線粒體。本文主要針對受精后精子線粒體的命運(yùn)與泛素-蛋白酶體間的關(guān)系作一綜述。

精子；線粒體DNA；泛素；卵母細(xì)胞；蛋白酶體

1 泛素化及泛素-蛋白酶體通路

1.1 泛素化泛素（ubiquitin）泛素化泛素是由76個(gè)氨基酸組成的一類低分子量的球形熱穩(wěn)定蛋白，其結(jié)構(gòu)在真核細(xì)胞中高度保守。泛素能以自由的形式存在，也能和其他蛋白形成復(fù)合物。泛素是通過一系列泛素啟動酶的作用而與靶蛋白連接的。泛素化修飾涉及到泛素激活酶E1（ubiquitinactivating enzyme）、泛素結(jié)合酶E2（ubiquitinconjugating enzymes）和泛素連接酶E3（ubiquitinligaseenzymes）的一系列反應(yīng)：首先在ATP供能的情況下E1粘附在泛素分子尾部的Cys殘基上激活泛素，并將激活的泛素轉(zhuǎn)移到E2上，隨后，E2攜帶泛素分子，在具有辨認(rèn)靶蛋白功能的E3指引下接近靶蛋白，對其進(jìn)行泛素化修飾。

泛素活化酶E1E1是催化泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第一個(gè)酶。它是一個(gè)廣泛存在的多肽，分子量為110～130 ku，對靶蛋白的識別幾乎沒有特異性［1］。

泛素結(jié)合酶E2E2是催化泛素與底物蛋白結(jié)合的第二個(gè)酶，E2含有一個(gè)保守的14～16 ku的核心區(qū)域，高等生物中E2的數(shù)量及種類要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酵母，每種E2可以與大量的E3相互作用，通過級聯(lián)的方式對大量底物進(jìn)行泛素化修飾。

泛素蛋白連接酶E3E3是泛素/蛋白酶體途徑中發(fā)現(xiàn)最遲、種類最多、在底物的特異性選擇降解過程中起到最為關(guān)鍵作用的成員［2-3］。在高等生物中，E3的總數(shù)從幾百到一千以上，新的E3亞家族仍在不斷的被發(fā)現(xiàn)。正是由于這些復(fù)雜多變的家族成員可以對不同的底物進(jìn)行特異性的識別，才呈現(xiàn)出蛋白降解的高度選擇性［4］。

據(jù)研究，又發(fā)現(xiàn)E3還有一個(gè)額外的成員，即泛素鏈延伸因子（ubiquitin chain elongation factor，又稱U-box蛋白，或E4）［5］。目前已發(fā)現(xiàn)許多泛素鏈延伸因子，它們在E1、E2的作用下，不需要E3就能使得泛素鏈得以延伸［6］。或許這些泛素鏈延伸因子也是另一類E3，具有促進(jìn)活化的泛素分子連接到短的泛素鏈上，而非連接到底物蛋白上的功能。

1.2 泛素-蛋白酶體通路泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是真核細(xì)胞除溶酶體途徑外的蛋白質(zhì)降解的主要途徑。泛素-蛋白酶體通路可能會參與到精子細(xì)胞器靶向的降解中。通過小鼠的相關(guān)研究表明，當(dāng)注入卵母細(xì)胞后，線粒體還沒消失時(shí)，精子線粒體能夠被卵母細(xì)胞特異識別［7］。同時(shí)，種間精子注射不會導(dǎo)致精子線粒體的消除而種內(nèi)注射則會導(dǎo)致精子線粒體的消除，這也再次證明了在受精后物種特異性的分子會為消除線粒體而服務(wù)。從哺乳動物系統(tǒng)的報(bào)告表明，精子線粒體的受精是與泛素相關(guān)的［8-9］。這與線蟲的結(jié)果一致，表明自噬也可能參與到消除這些父系線粒體的活動［10］。

2 受精后精子線粒體的命運(yùn)與泛素化之間的關(guān)系

2.1 精子和卵細(xì)胞線粒體精子線粒體是胞質(zhì)內(nèi)一種半自主性細(xì)胞器，是真核生物細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換體系和供能中心。存在于大多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)胞器中，它的蛋白合成受到核基因組和自身基因組的雙重控制。哺乳動物機(jī)體內(nèi)每個(gè)細(xì)胞都含有線粒體，每個(gè)線粒體內(nèi)含有1～10個(gè)線粒體DNA（mtDNA），mtDNA是一個(gè)16 569 bp的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，能夠編碼22種tRNA，2種rRNA和13種多肽。這些多肽都參與呼吸鏈復(fù)合體的亞單位組成［11］，因?yàn)槿鄙俳M蛋白的保護(hù)以及源自呼吸鏈產(chǎn)生的自由基的傷害，致使mtDNA具有高突變率［12］。精子線粒體位于精子尾部的中段，具有完整的電子呼吸鏈，為精子進(jìn)行各種活動及尾部鞭毛的擺動提供所需的能量［13］。被泛素化的精子線粒體在卵母細(xì)胞內(nèi)被卵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體降解，受精時(shí)僅有卵母細(xì)胞的線粒體參與，因此也叫母性遺傳。

卵母細(xì)胞線粒體在哺乳動物卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育的過程中，胞質(zhì)內(nèi)線粒體經(jīng)歷了階段性的空間再分布［14］，因此線粒體在胞質(zhì)中的重新分布是與卵子的發(fā)育潛能密切相關(guān)的。線粒體中含有的線粒體DNA（mtDNA），是獨(dú)立于細(xì)胞核DNA之外的遺傳物質(zhì)，其長度約有16.5 kb，分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)，編碼區(qū)共編碼37個(gè)基因，即22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因和13種蛋白多肽；非編碼區(qū)即線粒體基因組的控制區(qū)，包括HV（Hypervariable region）區(qū)、DLoop區(qū)及復(fù)制轉(zhuǎn)錄區(qū)，調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。mtDNA完整性和拷貝數(shù)變化都可以通過影響呼吸鏈功能干擾卵子的正常成熟［15］。目前，關(guān)于活性線粒體在不同動物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中分布及mtDNA拷貝數(shù)的相關(guān)研究已經(jīng)有很多報(bào)道，說明卵母細(xì)胞線粒體也越來越受到當(dāng)今社會的重視。

2.2 父系線粒體遺傳Schwartz等［16］對1例患者的線粒體進(jìn)行鑒定時(shí)觀察到其突變的線粒體來源于父親，這也就明確地證實(shí)了父系mtDNA不僅能夠存活，而且在成人的線粒體庫和骨骼肌中也占一定的比重。Gyllen等首先證實(shí)，種間雜交小鼠子代中父系線粒體不僅能存活，且后代所有組織中有0.01%～0.1%的線粒體源于父親。

然而Kaneda等人對Gyllen的結(jié)果持懷疑態(tài)度，他發(fā)明了一種能在單個(gè)小鼠胚中檢測到源自一個(gè)精子mtDNA拷貝數(shù)的新方法。通過這種方法，他們觀察到M.musculus小鼠種內(nèi)雜交的mtDNA在原核期之后就消失了，而M.musculus和M.spretus小鼠種間雜交，其父系mtDNA從原核期到新生鼠期都能被檢測得到，但卻并不傳遞到子代的任何組織中［17］。因此他們推理卵母細(xì)胞胞質(zhì)中存在某種因子，能夠識別同種核基因編碼精子線粒體中的某種組分，而不識別精子線粒體基因組本身編碼的產(chǎn)物。

在鳥類中也觀察到有父系mtDNA遺傳的現(xiàn)象［18］；此外，在蚌中，父系mtDNA能夠以非常高的比例遺傳到雄性子代中。在很多雙殼貝物種中，精子父系mtDNA和卵母細(xì)胞母系mtDNA都能遺傳給后代，這種遺傳被稱為雙重單親繼承現(xiàn)象（doubly uniparental inheritance，DUI）。精子mtDNA通過雄性子代的生殖腺得到傳遞，而卵母細(xì)胞的mtDNA既可以通過子代的體細(xì)胞遺傳也可以通過雌性子代的生殖腺進(jìn)行遺傳［19］。

經(jīng)過總結(jié)，mtDNA的父系遺傳方式目前為止有以下3種機(jī)制：①父系mtDNA的滲漏機(jī)制，即受精卵胞質(zhì)中的溶酶體以及蛋白水解酶對精子線粒體上普遍存在的蛋白標(biāo)記的識別具有一定的特異性，當(dāng)同源性較差時(shí)識別程度就要降低甚至不能識別，從而發(fā)生滲漏現(xiàn)象；②mtDNA的重組，即當(dāng)卵子受精后，如果某個(gè)受精卵中存在重組時(shí)父系mtDNA就會通過重組與母系mtDNA一起保留在胚胎中，這樣產(chǎn)生的胚胎能發(fā)育成熟并且產(chǎn)生具有性活力和生育能力的后代，父系mtDNA就會傳遞給后代，表現(xiàn)出父系遺傳。③其他解釋機(jī)制。mtDNA的遺傳可能還與基因有關(guān)，在隱球菌（Cryptococcus neoformens）MATa位點(diǎn)存在大約100 kb的區(qū)域可控制mtDNA的遺傳，當(dāng)這一基因受到破壞時(shí)，mtDNA就會呈現(xiàn)出雙親遺傳方式和重組。這些機(jī)制都不是獨(dú)立存在的，而是相輔相成的。但是對于每一種機(jī)制來說，現(xiàn)在的研究都不是很清楚，所以父系遺傳真正的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究［20］。

2.3 母系線粒體遺傳線粒體是精子動力的主要能源提供者。在哺乳動物中，除了核基因，線粒體DNA（mtDNA）也通過編碼13肽來為影響ATP產(chǎn)生的氧化磷酸化做出貢獻(xiàn)。線粒體是具有多種細(xì)胞功能且至關(guān)重要也十分有趣的細(xì)胞器，除了產(chǎn)生ATP的基本功能以外，線粒體也作用于很多生理過程，如鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)和氨基酸代謝等。

在1974年Hutchison等人發(fā)現(xiàn)騾子的mtDNA是從母性親本遺傳下來的之后，又有實(shí)驗(yàn)證明幾乎在所有器官中，mtDNA只從一個(gè)親本遺傳。在哺乳動物中，mtDNA通常是從雌性遺傳下來的，這也就被認(rèn)為是母性線粒體遺傳。大量的細(xì)胞譜系與種族發(fā)育學(xué)研究結(jié)果都表明，在生命的初期，母性的線粒體遺傳對于保持mtDNA的同質(zhì)性和個(gè)體的健康是很重要的，這種遺傳方式可能會減少不必要的致死性細(xì)胞質(zhì)基因表達(dá)競爭和阻止由于自由基作用導(dǎo)致精子線粒體損傷而影響到下一代［21-24］，因?yàn)榧词?個(gè)正常的mtDNA混合在一起，它們也會產(chǎn)生異質(zhì)性，如果這種異質(zhì)性發(fā)生在人類身上，常引起累積致死性的生物能量代謝障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?5］。

事實(shí)上，在生殖細(xì)胞成熟過程中就已決定精子和卵母細(xì)胞的線粒體具完全不同的命運(yùn)［26］。隨著生殖細(xì)胞的成熟過程會逐步影響線粒體在胚胎階段的增殖能力，不管是精子還是卵母細(xì)胞，它們的線粒體數(shù)目、結(jié)構(gòu)和分布都會隨著時(shí)期的改變而改變［27］。在配子發(fā)生的過程中，精子線粒體嵴的數(shù)目是呈現(xiàn)動態(tài)變化的，從減數(shù)分裂一開始它的結(jié)構(gòu)就發(fā)生了很大的變化，由普通嵴型變?yōu)閹缀鯖]有嵴結(jié)構(gòu)的卵圓型，這類少嵴結(jié)構(gòu)的線粒體多見于精母細(xì)胞的粗線期，在精子發(fā)生后期多嵴結(jié)構(gòu)的線粒體又開始多起來，在合子中我們可以通過嵴數(shù)目等結(jié)構(gòu)上的差異將精子線粒體與卵母細(xì)胞線粒體區(qū)分開［28］。

mtDNA被降解的過程可以分為以下2個(gè)步驟：①在精子的形成期，mtDNA的數(shù)目逐漸減少；②受精后，mtDNA被迅速降解，這有助于防止有害的精子mtDNA的產(chǎn)生、擴(kuò)散和傳代［29］。

2.4 精子線粒體在受精過程中的重要地位的研究進(jìn)展線粒體是哺乳動物細(xì)胞中最為重要的細(xì)胞器之一，它通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供正常的生理需求所需的ATP，細(xì)胞生命活動所需能量的95%都是由線粒體以ATP的方式所提供的［1］。經(jīng)過研究顯示，克隆動物的線粒體只能來源于卵受的體細(xì)胞質(zhì)或者表現(xiàn)為卵受體細(xì)胞質(zhì)和供體核細(xì)胞來源的線粒體共存形式，而不是完全來源于供體核細(xì)胞。早期胚胎的發(fā)育過程對能量的要求很高，因此線粒體功能研究在早期胚胎中很重要。

目前克隆動物的效率仍然很低，早期胚胎的發(fā)育與妊娠比率也很低，克隆動物出生后的死亡率很高，這些都需要我們從線粒體功能是否健全的角度進(jìn)行考慮［30］。St.John在ICSI和IVF法的實(shí)驗(yàn)中對產(chǎn)生的異常胚胎中檢測父系mtDNA，共分析了32個(gè)樣本，在2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期和8-細(xì)胞期都能檢測到父系mtDNA，因此他認(rèn)為在改變遺傳環(huán)境后，父系mtDNA在人類胚胎中能夠存活［31］。2011年通過對哺乳動物線粒體的遺傳方式的研究得出：目前在哺乳動物的克隆研究中，對供體細(xì)胞和受體卵胞質(zhì)來源的線粒體命運(yùn)還沒有發(fā)現(xiàn)完全一致的規(guī)律，克隆動物的效率很低，早期胚胎的發(fā)育、妊娠率低，而克隆動物出生后的死亡率卻很高，這些對弄清克隆動物及早期胚胎中線粒體存在的狀態(tài)和變化規(guī)律有很重要的意義，從而逐步提高克隆效率并推動克隆技術(shù)在多方面的應(yīng)用［32］。

2.5 精子線粒體消失機(jī)制目前就胚胎發(fā)育后期檢測不到精子線粒體，主要有3種解釋：①由于精子所攜帶的線粒體數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于卵母細(xì)胞，受精后精子線粒體可能會被降解，但是否被完全降解，目前還不能下定論。②精子mtDNA與卵母細(xì)胞mtDNA發(fā)生重組融合，因?yàn)楹献觾?nèi)存在重組融合mtDNA的酶，所以推測這種酶只起保護(hù)mtDNA的作用，但目前還不能證實(shí)這一假設(shè)。③精子線粒體被泛素化，隨后被蛋白酶降解［33］。通過微注入抗泛素的抗體或抑制溶酶體酶活性的物質(zhì)，可以防止線粒體的降解。最新技術(shù)已在多種物種的線粒體鞘上檢測到泛素，而在種間雜交的合子中并沒有顯示精子線粒體被泛素化，這也與原來的研究結(jié)果（即在種間雜交時(shí)父系mtDNA得到保留）相一致。

2.6 受精后線粒體的消失與泛素化的關(guān)系泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是一種重要的，并且與真核細(xì)胞中底物特異性蛋白的降解緊密聯(lián)系的體系。UPS也是受精后父系線粒體蛋白降解的一種很好的方法。通過多泛素鏈標(biāo)記的蛋白會通過26S蛋白酶識別，之后進(jìn)行降解，26S蛋白酶的分子量為2 000 ku，由30多個(gè)亞基組成，在結(jié)構(gòu)上由處于核心的20S蛋白酶和19S復(fù)合物兩部分組成。20S蛋白酶具有水解肽鍵的功能。19S復(fù)合物識別、接合和轉(zhuǎn)移泛素底物蛋白上的多泛素鏈，為通過3個(gè)駐留蛋白酶的20S核心的降解充當(dāng)引物并改變自身的位置。底物蛋白被分解成3～20氨基酸的小肽，從蛋白酶釋放并通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白酶降解成單個(gè)的氨基酸［34］。

泛素蛋白的消除可以由蛋白酶體的活性控制，這也和器官降解的自噬途徑相聯(lián)系。蛋白酶體抑制劑也會鎖定哺乳動物卵膜和透明帶的滲透，也就是會在精子的透明帶反應(yīng)中起作用［35］。線粒體幾乎存在于所有真核細(xì)胞中，對于細(xì)胞能量的生產(chǎn)、鈣信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和許多其他的細(xì)胞功能都是至關(guān)重要的。線粒體及其DNA的母系遺傳在人類和動物中可以被普遍觀察到。父系線粒體基因組的突變和/或遺傳與多種人類疾病相關(guān)聯(lián)。受精后不久，父系線粒體的消除是阻止線粒體基因組異常潛在危險(xiǎn)的第一道防線。通過對現(xiàn)有關(guān)于線粒體遺傳的文獻(xiàn)的研究，父系mtDNA的消除可以通過多種機(jī)制來完成［36］。

精子線粒體在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被泛素化，隨后在早期發(fā)育過程中進(jìn)行水解［37］。精子內(nèi)的線粒體經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆核鼗赡苁故芫膸茁首兏撸驗(yàn)樗鼈兪峭ㄟ^附睪中多余的泛素-蛋白酶體途徑泛素化的［38］。事實(shí)上，最近的一個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究指出個(gè)人多于4 600類精子蛋白質(zhì)中約有220個(gè)是具有精子特異性的。因?yàn)榉核厥鞘状螐孽q鱒魚和哺乳動物的睪丸中發(fā)現(xiàn)的，所以超過30種的泛素化酶已被確認(rèn)為是精子的重要調(diào)控酶。據(jù)估計(jì)，大約有70種E3泛素連接酶在小鼠精子發(fā)生的過程中表達(dá)，這表明泛素系統(tǒng)具有多種功能［39］。

目前，對C型線蟲胚胎的研究可表明父系線粒體的泛素化和消除時(shí)期為精子線粒體進(jìn)入卵子中進(jìn)行融合時(shí)。這些線粒體與最初的膜器官（MOs）聯(lián)系在一起，MOs被快速的泛素化。在母系減數(shù)分裂過程中MOs和線粒體的數(shù)目迅速下降。受精后精子線粒體和MOs最初是成群的，而在細(xì)胞質(zhì)流動和第一次有絲分裂的初期，這些器官開始在合子細(xì)胞質(zhì)中分散。

3 展望

綜上所述，線粒體作為為細(xì)胞提供能量的工廠，在遺傳過程中起著相當(dāng)重要的作用，一旦精子線粒體中發(fā)生任何障礙，都會引起許多線粒體疾病，導(dǎo)致受精的失敗。精子線粒體在獲能或頂體反應(yīng)時(shí)發(fā)生泛素化，進(jìn)入卵母細(xì)胞后被卵母細(xì)胞自身的蛋白酶體降解，基于已有的報(bào)道，泛素-蛋白酶通路體系在精子發(fā)生和受精過程中都有極其重要的作用［39］。因此，通過對受精后精子線粒體命運(yùn)的探究，會對以后關(guān)于研究種間或種內(nèi)精子線粒體何時(shí)發(fā)生泛素化、獲能或頂體反應(yīng)等問題有很大的幫助。

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Relationship between the Fate of the Sperm Mitochondria after Fertilization Andubiquitin-proteasome-pathway

SHI Wen-shu，JIN Yi*
（Agricultural College of Yanbian Unicersity，Jilin Yanji 133002，China）

In most mammals，the process of fertilization involves the fusion of sperm and the egg cell.Although sperm contains mitochondrion when sperm and egg begin combining，the mitochondrion genome of male parent will not be inherited theiroffspring.Therefore，the mitochondriongenome almost inherit from maternal in most animals.The sperm mitochondrias have been marked by ubiquitin before they enterthe oocyte.However，it could be degraded by its proteasome after entering the oocyte.Only oocyte mitochondrion existed after fertilization.This paper mainly aimed at the relationship between the fate of the sperm mitochondrion after fertilization and ubiquitin-proteasome pathway.

spermatozoa；mtDNA；ubiquitin；oocyte；proteasome

S814.1

：A

：0258-7033（2015）19-0095-05

2015-01-15；

2015-03-17

農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)科研項(xiàng)目

史文姝（1993-），女，碩士，E-mail：454757450@qq.com

*通訊作者：金一，E-mail：yijin@ybu.edu.cn