李焰，鄧心慰，曾福炎，王華，2，尹會方，2（.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖364000；2.預防獸醫(yī)學與生物技術福建省高等學校重點實驗室，福建龍巖364000）

銀杏葉復方對免疫抑制小鼠細胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響

李焰1，2*，鄧心慰1，曾福炎1，王華1，2，尹會方1，2
（1.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖364000；2.預防獸醫(yī)學與生物技術福建省高等學校重點實驗室，福建龍巖364000）

本試驗旨在研究銀杏葉復方（YXF）和四君子湯（SJZ）對環(huán)磷酰胺（CY）所致免疫抑制模型小鼠細胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響。KM種小鼠180只，雌性，隨機分為6組，每組6個重復，每個重復5只。A為對照組（CK），B為CY組，C為YXF組，D為CY+YXF組，E為SJZ組；F為CY+SJZ組。A、B和C、D、E、F組分別每天灌服蒸餾水和相應制劑0.3 mL/只，A、C、E和B、D、F組分別按照75 mg/kg體重隔日腹腔注射生理鹽水和CY，連續(xù)15 d。結果表明：CY組的IL-1、TNF-a含量較CK組顯著下降（P＜0.05），CY+YXF組的IL-1和TNF-a含量較CY組有所增加（P＞0.05）；CY+SJZ組TNF-a含量較CY組有所降低（P＞0.05）。CY組的肝細胞出現(xiàn)空泡樣變性，CY和CY+SJZ組脾臟紅白髓界限不明顯；CY+YXF組肝細胞板完整，白髓大而明顯；CY+SJZ組肝細胞形態(tài)結構基本正常。結論，YXF制劑通過調控細胞因子生成，對CY介導的免疫抑制小鼠的細胞免疫發(fā)揮正向調節(jié)作用，拮抗CY對肝脾組織造成的損傷，效果優(yōu)于SJZ。

銀杏葉復方；免疫抑制小鼠；細胞因子；病理變化

目前在養(yǎng)殖過程中由于化藥、抗生素的盲目濫用和嚴重超標，導致畜禽適應能力和抗病能力下降，也造成多病原疫病流行，由此發(fā)生的食品安全問題屢見不鮮。中藥則在協(xié)調機體平衡，增強機體抗病能力方面具有獨特療效［1］，將中醫(yī)理論應用于動物身上，將“治未病”作為動物保健的前提，能夠減少疫苗、化學藥物及抗生素的使用。中醫(yī)認為“四季脾旺不受邪”，脾失健運，氣血生化能力下降，表現(xiàn)為免疫功能的低下。許多研究表明，脾虛動物均有明顯的免疫功能低下，其中又以細胞介導的免疫功能所受影響更明顯［2］。前期研究發(fā)現(xiàn)，脾虛小鼠存在神經(jīng)-內分泌-免疫網(wǎng)絡之間的調節(jié)失衡，最終引起脾虛時的機體免疫功能低下，經(jīng)銀杏葉復方治療后上述免疫失調得到明顯糾正［3］；銀杏葉復方的急性毒性、最大耐受量及細胞毒性研究表明該方劑毒性很小，臨床使用安全［4］；飼糧中添加適量的銀杏葉復方制劑，可維持和養(yǎng)護斷奶肉兔的小腸黏膜組織［5］。為進一步探討銀杏葉復方對免疫功能的調節(jié)作用，本研究根據(jù)中藥方劑的組方原則，以具有免疫調節(jié)作用的四君子湯為對照，觀察了銀杏葉復方對CY所致免疫抑制模型小鼠細胞因子和肝脾組織形態(tài)的影響，為組方優(yōu)化以及用于動物養(yǎng)殖實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料環(huán)磷酰胺（Cy）（0.2 g/支），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號：10030921。每支Cy用10 mL生理鹽水溶解，以75 mg/kg的劑量進行腹腔注射。

四君子湯為以3∶3∶3∶1配比的黨參、白術、茯苓、炙甘草，選自《太平惠民和劑局方》。

銀杏葉復方制劑包括銀杏葉、黃芪、黨參、白術、茯苓、砂仁、陳皮。銀杏葉粉購自長沙博鍵生物科技有限公司，產(chǎn)品標準號：Q/ADPG001-2008；其余藥物均購自龍巖市第一醫(yī)院，質量符合中華人民共和國獸藥典標準。

以上2種方劑按比例配比，采用傳統(tǒng)水煎法：蒸餾水預行浸泡2 h，加熱煎煮2次，第1次保持微沸30 min，濾出藥液；藥渣加溫水再煮沸，仍保持微沸30 min，濾出藥液；合并2次濾液，小火濃縮至1 g/mL（按照生藥量計算）。

1.2 試驗動物6周齡清潔級KM種小鼠，雌性，體質量25～30 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證編號2007000564825。

1.3 免疫抑制小鼠模型的建立選用細胞毒化療藥物—CY制作免疫抑制模型，臨床研究表明CY也是一種免疫抑制劑，使小鼠細胞免疫功能受到明顯的抑制，可建立長期免疫低下模型［6］。經(jīng)預試驗以小鼠精神沉郁、怕冷、扎堆，體重顯著減輕表示模型制作成功，CY的使用劑量為每支Cy用10 mL生理鹽水溶解，以75 mg/kg的劑量進行腹腔注射。

1.4 動物分組與處理KM種小鼠180只，隨機分為6組，每組6個重復，每個重復5只小鼠。試驗設計及分組見表1。各組灌服蒸餾水和相應制劑的劑量為0.3 mL/只，每天1次；生理鹽水和CY的劑量按照75 mg/kg體重腹腔注射，隔日一次。連續(xù)15 d。

表1 試驗設計及分組

1.5 血清中細胞因子含量的測定末次給藥各組小鼠禁食不禁水，12h后眼眶采血1mL，離心（3500r/min） 15 min，取血清，放入EP管，-70℃保存。采用放射免疫方法檢測白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。試劑盒均由北京華英生物技術研究所提供，嚴格按照試劑盒說明操作。

1.6 切片的制作和觀察將采血后小鼠的肝和脾用體積分數(shù)10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)方法制備切片并HE染色，光鏡下進行組織病理學檢查。

1.7 統(tǒng)計分析應用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan′s多重比較，所有數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。

2 結果

2.1 銀杏葉復方制劑對免疫抑制小鼠血清中細胞因子IL-1、IL-6和TNF-a含量的影響由表2可見，CY組的IL-1含量較CK組顯著下降（P＜0.05），YXF組與SJZ組IL-1的含量較CK組顯著增加（P＜0.05），CY+ YXF組IL-1的含量較CY組有所增加但差異不顯著（P＞0.05）；CY+SJZ組IL-1的含量較CY組顯著提高（P＜0.05），與CY+YXF組含量相比差異不顯著（P＞0.05）；CY組IL-6的含量與其他各試驗組相比差異不顯著（P＞0.05）；CY組TNF-α含量較CK組顯著下降（P＜0.05），YXF組與CY+YXF組TNF-α含量較CY組有所增加，但差異不顯著（P＞0.05），SJZ組和CY+SJZ組TNF-α含量較CY組有所降低，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 銀杏葉復方制劑對免疫抑制小鼠血清中細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α含量的影響ng·mL-1

2.2 銀杏葉復方對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠肝脾組織形態(tài)的影響經(jīng)采血后的小鼠進行處死解剖取肝臟、脾臟，可明顯觀察到凡注射過CY的小鼠，脾臟均有不同程度的萎縮，肝臟及其他臟器未見明顯肉眼可見病變。對肝和脾進行組織病理學檢查可見，CK組和YXF組小鼠肝細胞板完整，排列規(guī)則，細胞膜形態(tài)完整，無炎性細胞浸潤，細胞核大而深染，位于細胞中央（分別見圖A1、C1），脾組織中的白髓大而明顯（分別見圖A2、C2）；CY組的肝出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，肝細胞核濃染（核濃縮），有的細胞核已消失，部分肝細胞出現(xiàn)空泡樣變性，可見壞死的肝細胞（圖B1），脾臟紅白髓界限不明顯，結構雜亂，脾小梁密集（圖B2）；相對于CY組，CY+YXF組小鼠肝細胞板完整，排列規(guī)則，細胞核大而深染，胞質染色均勻，肝組織未見明顯病變（圖D1），脾組織中的白髓大而明顯（圖D2）；SJZ組肝臟細胞個別出現(xiàn)核濃縮甚至核消失（見E1），脾臟白髓?。ㄒ奅2）；CY+SJZ組肝細胞的腫脹現(xiàn)象減輕，少見肝細胞壞死和空泡樣變性，肝細胞形態(tài)結構基本正常（F1），脾臟紅白髓界限不明顯，脾小梁密集（圖F2）。以上結果表明，銀杏葉復方能有效拮抗CY對肝脾組織造成的損傷，效果優(yōu)于四君子湯。

圖1 小鼠肝臟病理組織學觀察（HE染色，400×）

圖2 小鼠脾臟病理組織學觀察（HE染色，40×）

3 討論

CY是一種細胞毒性藥物，同時也屬于烷化劑類免疫抑制劑，作為一種化療藥物，因具有明顯的殺傷腫瘤作用，在腫瘤治療中被廣泛應用。其作用主要是破壞DNA的結構，它能殺死有絲分裂和進入循環(huán)周期的細胞，具有較強的免疫抑制作用，故在免疫學研究中，常以CY作為細胞免疫、體液免疫中的免疫抑制模型的制備藥物［7-9］。臨床實踐證明，在拮抗化療損傷方面，中醫(yī)藥有獨特優(yōu)勢，具有扶正祛邪的復方制劑目前被廣泛應用于臨床。如韓春楊等［10］研究發(fā)現(xiàn)，自擬中藥免疫調節(jié)劑對免疫抑制小鼠血細胞數(shù)、體質量、脾臟指數(shù)以及脾、肝組織病理學均表現(xiàn)出一定的正向調節(jié)作用；吳軍等［11］研究了四君子湯、六味地黃湯對CY致小鼠免疫抑制的拮抗作用，結果表明CY能明顯降低小鼠脾指數(shù)，抑制胸腺細胞增殖，誘導脾細胞凋亡，而四君子湯和六味地黃湯能顯著提高脾指數(shù)，促進胸腺細胞增殖及抑制脾細胞凋亡。本試驗中免疫抑制組小鼠的血清中Th1型細胞因子，如TNF-α和IL-1較對照組顯著降低，而Th2型細胞因子IL-6含量與對照組無顯著性差異，Th1/Th2細胞比例失調，可能的作用機制是由CY導致了機體免疫功能的失調，詳細機制有待于進一步研究。

試驗采用CY制作小鼠的免疫抑制模型，顯示其對機體免疫功能的損傷是多方面的。從細胞因子角度分析，CY阻抑了多種細胞因子（IL-1、IL-6和TNF-α）的產(chǎn)生；從形態(tài)學角度分析，CY則引起小鼠肝臟和脾臟細胞的病理學變化，銀杏葉復方制劑對通過調控細胞因子生成，對CY介導免疫抑制模型小鼠的細胞免疫發(fā)揮著正向調節(jié)作用，能有效拮抗CY對肝脾組織造成的損傷，這種作用與銀杏葉復方組成有關。中醫(yī)理論中肝為剛臟，其性疏泄調達，有賴于脾生化之水谷精微濡養(yǎng)，才能剛柔相濟，體陰而用陽，則稱為“脾土營肝木”。若脾失健運，水濕停聚，壅塞氣機，反侮肝木，致肝失疏泄，即“土壅侮木”［12］，方中，銀杏葉味甘、苦、澀，性平，歸心、肺經(jīng)，具有斂肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效［13］。現(xiàn)代藥理學研究表明，銀杏葉所含化學成分相當復雜，包括黃酮類、萜類、生物堿、多糖、酚類及氨基酸等。其中黃酮類和萜內酯是銀杏葉中發(fā)揮獨特藥理活性的有效成分，而且是銀杏葉及其中間品和植物藥制劑質量標準化的重要依據(jù)［14］。近年研究發(fā)現(xiàn)，其藥理作用范圍不斷擴大，特別是具有促進毛細血管循環(huán)以及營養(yǎng)脾胃和心腦臟器功能的作用［15］。黃芪、黨參為補氣健脾、益血首選藥物，三藥合用具有補氣健脾、提升脾胃消化功能之功效，是為君藥，白術補氣健脾，燥濕利水，協(xié)助君藥以健脾化濕，使脾胃功能更旺，為臣藥。茯苓利水滲濕、健脾為佐，砂仁、陳皮化濕行氣，調中是為使藥。中藥五行理論認為心屬火，脾屬土，而火又生土，故銀杏葉有利脾之功效，諸藥合用共奏補氣健脾、營養(yǎng)臟器、行氣化濕之功效，脾胃功能旺盛，營養(yǎng)充足則免疫力增強。

4 結論

銀杏葉復方制劑通過調控細胞因子生成，對環(huán)磷酰胺介導免疫抑制模型小鼠的細胞免疫發(fā)揮正向調節(jié)作用，能有效拮抗CY對肝脾組織造成的損傷，效果優(yōu)于四君子湯。

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Effect of Ginkgo Biloba Compound on Cytokines and Histomorphology of Liver and Spleen in Immunosuppressive Mice

LI Yan1，2*，DENG Xin-wei1，ZENG Fu-yan1，WANG Hua1，2，YIN Hui-fang1，2
（1.Collge of Life Science，Longyan University，F(xiàn)ujian Longyan 364000，China；2.Key Laboratory of Fujian Universities Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology，F(xiàn)ujian Longyan 364000，China）

This experiment was conducted to study the Ginkgo biloba compound on cytokines and histomorphology of liver and spleen in the cyclophosphamide（CY）induced immunosuppression mice.A total of 180 female，KM mice were divided randomly into 6 groups with，six replicates and five in each.Group A was control group with normal mice（CK）.Group B was cyclophosphamide induced mice（CY）.Group C was normal mice fed with Ginkgo biloba compound as the therapeutic drug（YXF）.Group D was cyclophosphamide induced mice fed with Ginkgo biloba compound as the therapeutic drug（CY+YXF）.The last two groups were E（SJZ）and F（CY+SJZ），which were both administered by Sijunzi decoction and consisted of normal mice and cyclophosphamide induced mice respectively.Group A and B were administered with 0.3 mL distilled water everyday，while group C/D and group E/F were injected Ginkgo biloba compound and Sijunzi decoction as the same volume.The results showed that The content of IL-1，TNF-α was decreased significantly（P＜0.05）in group CY when compared with group CK.The contents of IL-1，TNF-α in group D（CY+YXF）were increased（P＞0.05）when compared with group CY.The level of TNF-α in group F（CY+SJZ）was lower than group CY（P＞0.05）.Moreover，hepatic vacuolar degeneration was found and red pulp's boundary in spleen was not clear in group CY，while the hepatic cell were aligned and integrated and the white pulp in spleen tissue was clear in group CY+YXF.In group CY+SJZ，the liver swelling was reduced and hepatic cell vacuoles degeneration was rarely happened.But the red and white pulp line in spleen was not obvious.The result indicatedthat the Ginkgo biloba compound could effectively inhibit CY induced damage of liver and spleen by generating regulatory cytokines and enhancing function of the immune cell in immunosuppression model mice.Furthermore，the therapeutic effect of Ginkgo biloba compound was better than Sijunzi decoction.

compound of Ginkgo biloba；immunosuppressive mice；cytokine；pathologic changes

S865.5

：A

：0258-7033（2015）19-0071-04

2015-02-11；

2015-05-07

國家自然科學基金面上項目（31470129）；龍巖市科技局項目（2014LY24）；福建省自然科學基金項目（2012J01142）

李焰（1968-），女，四川安縣人，碩士，教授，主要從事飼料添加劑研究，E-mail：529783204@qq.com

*通訊作者