周曉波，趙成鵬，王鎏，張朋，唐旭，段永福

（河南省南陽市中心醫(yī)院小兒外科，河南 南陽 473000）

·論著·

腫瘤抑素影響嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的相關(guān)機制

周曉波，趙成鵬，王鎏，張朋，唐旭，段永福

（河南省南陽市中心醫(yī)院小兒外科，河南 南陽 473000）

目的觀察腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡的影響，并對相關(guān)機制進行初步探討。方法采用0、5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素及40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞0、12、24和48 h，采用MTT方法及流式細胞術(shù)檢測嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖及凋亡情況。采用Western blot方法檢測嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中AMPK和mTOR的磷酸化水平。結(jié)果同0μg/ml腫瘤抑素處理組相比，5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素均可顯著抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖能力，并促進嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞的凋亡（P＜0.05），且這種作用具有計量依賴性。同0 h處理組相比，40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞2、24和48 h均可顯著抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖能力，并促進嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞的凋亡（P＜0.05），且這種作用具有時間依賴性。同對照相比，腫瘤抑素可上調(diào)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中AMPK的磷酸化水平，下調(diào)mTOR的磷酸化水平。結(jié)論腫瘤抑素可通過激活A(yù)MPK通路，進而抑制mTOR通路，從而抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖能力，并促進嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞的凋亡。

腫瘤抑素；嬰幼兒血管瘤；內(nèi)皮細胞；增殖；凋亡

嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，其發(fā)病率約為4%～12%。目前針對嬰幼兒血管瘤的治療方法包括類固醇激素治療和常規(guī)抗腫瘤藥物治療等[1]。血管生成是嬰幼兒血管瘤發(fā)生的先決條件，其在嬰幼兒血管瘤快速生長中發(fā)揮重要的作用[1]。腫瘤抑素（tumstatin）是新近發(fā)現(xiàn)的一種起源于血管基底膜IV型膠原的內(nèi)源性血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子[2-4]，由244個氨基酸組成，分子量約為28 kD。腫瘤抑素是一種很強的血管生成抑制因子，可選擇性地抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，是目前發(fā)現(xiàn)的一種具有良好的應(yīng)用前景的抗血管生成和抗腫瘤藥物[5]。然而，目前關(guān)于腫瘤抑素在嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮發(fā)生發(fā)展中的作用，以及腫瘤抑素發(fā)揮作用的機制還很少有文獻報道。據(jù)此，本研究通過體外分離獲取嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞，觀察了腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡的影響，并對腫瘤抑素發(fā)揮作用的機制進行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1主要試劑

p-AMPK抗體和p-mTOR抗體購自Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購自Snata Cruz公司，Cyto-Buster蛋白提取試劑購自Novagen公司，蛋白酶和磷酸酶抑制劑購自Thermo公司。

1.2嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞獲取及鑒定

嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞獲取及鑒定方法參見文獻報道[1]。

1.3細胞處理

采用0、5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素及40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞0、12、24和48 h。

1.4MTT方法檢測細胞增殖能力

上述腫瘤抑素處理的細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于96孔培養(yǎng)板中，采用不同濃度和不同時間的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞后，每孔中加入20μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150μl的二甲基亞砜（DMSO）溶液，低速震蕩10 min后，波長490 nm處測定OD值。

1.5凋亡檢測

收集上述腫瘤抑素處理細胞離心，1 000×g離心5 min，以含1%BSA的磷酸緩沖液（PBS）洗滌1次。用100μl Binding緩沖液將細胞重懸，加入2μl Annexin V染料和0.1μl PI染料，避光15 min，以含1%BSA的PBS洗滌2次。

1.6細胞總蛋白提取

上述細胞采用冰PBS洗滌2次，400×g離心，5 min；棄去細胞上清，于沉淀中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑和CytoBuster蛋白提取試劑，吹打混勻，室溫放置15 min；4℃，12 000×g離心15 min；所得上清部分即細胞總蛋白，留部分細胞總蛋白檢測蛋白濃度，其余每管15μl分裝，-80℃凍存。

1.7BCA法測定蛋白濃度

嚴格按BCA試劑盒說明書進行標準品BSA的稀釋；按體積比為50∶1混合試劑盒中的試劑A和試劑B，即為工作液；96孔板中每孔加入200μL的工作液，隨后加入25μl倍比稀釋的標準品或待測樣品，每種樣品設(shè)置3個復(fù)孔。37℃孵育30 min后波長562 nm處測定OD值；根據(jù)標準品的光密度值和濃度梯度繪制出標準曲線，根據(jù)標準曲線及待測樣品的OD值推算出樣品濃度。

1.8Western blot

等量的提取上述蛋白經(jīng)8%～10%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用含5%BSA的TBST室溫孵育封閉2 h，加入鼠抗人p-AMPK抗體或p-mTOR抗體，4℃過夜孵育。次日以0.1%TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)種屬的HRP標記二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST洗膜后，采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進行顯色。Actin作為內(nèi)參對照。所有實驗至少重復(fù)3次。使用Image J軟件進行定量分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的影響

如圖1所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時間的延長，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖能力逐漸降低（P＜0.01）。

2.2腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的影響

如圖2所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時間的延長，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡水平逐漸升高（P＜0.01）。

2.3 腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影響

如圖3所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時間的延長，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐漸升高。

2.4腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中mTOR蛋白磷酸化水平的影響

如圖4所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時間的延長，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中mTOR蛋白磷酸化水平逐漸降低。

3 討論

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶。細胞在接受外源營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子信號刺激后，均可通過mTOR信號通路向細胞內(nèi)傳遞信號。同時，mTOR信號通路的活化水平還受AMPK（AMP激活的蛋白質(zhì)激酶，AMP activated potein kinase）活化水平的的調(diào)節(jié)[6-7]。研究顯示，p53可通過調(diào)節(jié)AMPK/ mTOR信號通路的活化水平，進而調(diào)節(jié)細胞自噬[8-9]。同時，AMPK/mTOR信號通路在調(diào)節(jié)細胞生長增殖、存活、自噬、凋亡等生理過程中也具有重要的作用[10]。據(jù)此，本研究觀察了AMPK/mTOR信號通路在腫瘤抑素（tumstatin）調(diào)節(jié)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡水平中的作用。腫瘤抑素是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有很強的抑制血管生成作用的因子，可選擇性地抑制血管內(nèi)皮細胞增殖[5]。本研究通過分離獲取嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞，在體外采用不同濃度的腫瘤抑素及相同濃度的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞不同時間，以觀察腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡水平中的作用。結(jié)果顯示，在體外采用0、5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素及40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞0、12、24和48 h，與對照組相比，腫瘤抑素可顯著抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖，并促進嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡，且此作用具有劑量及時間依賴性。進一步對AMPK/mTOR信號通路在腫瘤抑素調(diào)控嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡中的作用研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑素可上調(diào)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞中AMPK的磷酸化水平，下調(diào)mTOR的磷酸化水平，且此作用同樣具有劑量及時間依賴性。腫瘤抑素的這種通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的作用與文獻報的亞硒酸鈉可通過調(diào)控結(jié)直腸癌HT-29細胞中AMPK及其下游靶蛋白mTOR而對HT-29細胞凋亡產(chǎn)生影響的結(jié)果相一致[11]。綜述所述，本研究結(jié)果提示，腫瘤抑素可通過調(diào)AMPK/mTOR信號通路的活化水平，進而調(diào)節(jié)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡水平。然而，關(guān)于其他信號通路分子，如p53分子是否在腫瘤抑素調(diào)控嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡中具有一定的作用還需進一步的深入研究。

[1]侯團結(jié),劉漪淪,李松平,等.腫瘤抑素對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖活力與細胞周期的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2013,17 (7):8-11.

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Effect of tumstatin on proliferation and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma

Xiao-bo ZHOU,Cheng-peng ZHAO,Liu WANG,Peng ZHANG,Xu TANG,Yong-fu DUAN
(Department of Pediatrics Surgery,Nanyang Central Hospital,Nanyang,Henan 473000,P.R.China)

【Objective】To observe the effect of tumstatin on proliferation and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma,and study the related mechanism.【Methods】Endothelial cell in infantile hemangioma was treated with tumstatin with different concentrations(0,5,10,20 and 40 μg/ml)or in a time dependent manner(0, 12,24 and 48 h),then the proliferation ability and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma were detected by MTT and FCM,phosphorylation level of AMPK and mTOR were detected by Western blot.【Results】Compared with 0 μg/ml tumstatin treated group,5,10,20 and 40 μg/ml tumstatin treated can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma(P＜0.05),and those effect were concentration dependent.Compared with 0 h tumstatin treated group,12,24 and 48 h tumstatin treated can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma(P＜0.05),and those effect were time dependent.Compared with control group,tumstatin treated can active AMPK signaling pathway and inhibit mTOR signaling pathway in endothelial cell in infantile hemangioma.【Conclusion】By active AMPK signaling pathway and inhibit mTOR signaling pathway, tumstatin can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma.

tumstatin;infantile hemangioma;endothelial cell;proliferation;apoptosis

R730

A

1005-8982（2015）28-0017-05

2015-04-26