實(shí)時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測肺癌患者血清VEGF-R的表達(dá)及意義

陳芳黃文碧周光群1李亞軍高曉霞鄒彥柏玉舉2

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院三病區(qū)，貴州遵義563003)

摘要〔〕目的探討肺癌患者血清中血管表皮生長因子受體(VEGF-R)的含量及其臨床意義。方法以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內(nèi)參照基因，使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)定量方法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測VEGF-R在肺癌患者化療前、中、后血清中的表達(dá)水平。結(jié)果33例肺癌患者接受化療前、化療中、化療后的VEGF-R水平存在差異性，兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，VEGF-R表達(dá)水平隨著化療的進(jìn)行逐漸降低(P<0.05)；肺癌患者血清中VEGF-R表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤分期均無明顯關(guān)系(P>0.05)，而低分化程度患者血清VEGF-R表達(dá)水平明顯高于高分化患者(P<0.05)，腺癌及其他病理其型患者明顯高于鱗癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。結(jié)論肺癌患者血清中VEGF-R表達(dá)水平在化療前后存在差異性，并且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為肺癌患者化療預(yù)后的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞〔〕肺癌；VEGF-R；GAPDH

中圖分類號〔〕R736〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：遵義醫(yī)學(xué)院碩士啟動(dòng)基金〔院字(2007)49號〕

通訊作者：柏玉舉(1969-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事肺癌、食道癌、乳腺癌等惡性腫瘤方面的研究。

1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)鏡科

2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院一病區(qū)

第一作者：陳芳(1974-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事頭頸、淋巴瘤、乳腺癌等惡性腫瘤方面的研究。

腫瘤生長與轉(zhuǎn)移依賴于血管生長，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)直接或間接刺激宿主的免疫細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，最終導(dǎo)致血管生長。腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生大量VEGF，通過旁分泌作用刺激周圍血管生成?，F(xiàn)在認(rèn)為VEGF〔1〕是最重要的促進(jìn)血管新生的因子之一，起著核心作用的血管形成正調(diào)節(jié)。本研究通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測肺癌患者化療前、中、后血漿VEGF受體(VEGF-R)水平，旨在為病情監(jiān)測、療效觀察及預(yù)后判斷提供客觀指標(biāo)。

1資料與方法

1.1研究對象選取2011年4月至2012年1月在我院接受治療的33例肺癌患者，男23例，女10例；年齡36～71歲，中位數(shù)52歲；所有患者按病理類型：26例鱗癌，5例腺癌，1例小細(xì)胞肺癌，1例支氣管鏡刷檢找到癌細(xì)胞；按發(fā)病部位：發(fā)生于右肺的15例，左肺患者18例；按分化程度：低分化25例，分化程度中等或高的8例；按是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：18例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，15例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；按腫瘤分期：10例Ⅰ、Ⅱ期，23例Ⅲ、Ⅳ期。非小細(xì)胞肺癌采用TP方案： 紫杉醇135～175mg/m2靜滴(第1天，d1)， 順鉑75 mg/m2(總量分3 d,d1～3)治療。小細(xì)胞肺癌采用EP方案：依托泊苷100 mg/m2靜滴(d1～d3)和順鉑25mg/m2(d1～d3)治療。以上方案21d為1個(gè)周期，均需完成4個(gè)期治療。

1.2儀器與主要試劑AllegraX-30R型低溫高速離心機(jī)購自美國BeckmanCoulter商貿(mào)(中國)有限公司，XW-80A型漩渦混合儀購自海門市其林貝雨儀器制造有限公司，普通擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司，Mini-6K微型離心機(jī)購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，CFX96Real-TimeSystem購自美國Bio-Rad公司。VEGFR及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物：上海捷瑞生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒、TRNzol：北京天根生化科技有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)：上海捷瑞生物工程有限公司；雙蒸水(用DEPC處理的)；75%乙醇(用去氨的雙蒸水配制)。VEGFR反向引物5'-GGCTCTTTCGCTTACTGTTCTG-3'，VEGFR正向引物5'-CTCTGCCTACCTCACCTGTTTC-3'，GAPDH反向引物5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'和GAPDH正向引物(5'-GGGCATCCTGGGCTACACTGAG-3')。

1.3方法

1.3.1單個(gè)核細(xì)胞的分離采靜脈抗凝(EDTA)血3ml，加Hank液3ml混勻，然后緩慢加入含有3ml淋巴細(xì)胞分離液的試管上層，2 000r/min離心15～20min，取中間白色條帶層(單個(gè)核細(xì)胞)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗滌3次(800r/min離心5min)懸浮于1mlTRNzol液(-85℃保存)。

1.3.2提取總RNATRNzol1ml+107/ml單個(gè)核細(xì)胞(組織塊超聲粉碎)→混勻→冰上5 min(不時(shí)振蕩呈黏稠狀)→加氯仿200 μl→混勻→ 13 000 r/min(4℃)離心10 min→取上清→加入500 μl(與上清等量)異丙醇→混勻→冰上靜置10 min→13 000 r/min離心10 min→棄上清→加入70%乙醇(DEPC水配)700 μl→ 13 000 r/min離心2 min(2次)→盡量棄上清→室溫倒置干燥→用DEPC水溶解后取5 μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(用紫外測純度及含量)。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄DNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作。

1.3.4熒光定量PCR擴(kuò)增〔2〕25μl反應(yīng)體系：2.5×RealMasterMix/20×SYBRsolution11.25μl，上下游引物2μl，模板2μl，無菌超純水9.75μl。擴(kuò)增條件為95℃ 2min(預(yù)變性)，95℃ 20s(變性)，52℃ 30s(退火) 40個(gè)循環(huán)，72℃ 10min，擴(kuò)增后4℃保存。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件多組之間的均值比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法、t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1肺癌患者化療前后VEGF-R水平變化在化療前、中、后VEGF-R水平(28.85±1.65、21.47±3.25、15.41±3.59)存在差異，并且兩兩之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，VEGF-R表達(dá)水平隨著化療的進(jìn)行逐漸降低(P<0.05)；化療前、中、后的VEGF-R/GAPDH比值(1.43±0.17、1.11±0.21、0.82±0.33)差異顯著(P<0.05)。化療前、中、后的GAPDH水平(20.36±2.11、19.55±2.09、19.39±2.73)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2肺癌患者化療前VEGF-R水平與可能影響因素的關(guān)系肺癌患者血清中VEGF-R表達(dá)水平與年齡〔≥60歲組(1.52±0.19)vs<60歲組(1.41±0.17)〕、性別〔男(1.45±0.19)vs女(1.42±0.16)〕、腫瘤分期〔Ⅰ、Ⅱ期(1.44±0.18)vsⅢ、Ⅳ期(1.42±0.17)〕均無明顯關(guān)系(P>0.05)，而低分化程度患者血清VEGF-R表達(dá)水平明顯高于高分化患者〔(1.57±0.21)vs(1.37±0.12)，P<0.05〕，腺癌及其他病理類型患者明顯高于鱗癌〔(1.48±0.19)vs(1.32±0.14)，P<0.05〕，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者〔(1.54±0.22)vs(1.40±0.16),P<0.05〕。

3討論

VEGF對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲過程有著關(guān)鍵性的作用。有研究表明〔2～4〕，在腫瘤形成早期，由于腫瘤組織低氧環(huán)境、代謝性應(yīng)激的誘導(dǎo)以及癌基因激活，打破成熟血管休眠期，上調(diào)促血管新生因子表達(dá)，引發(fā)血管新生。血管新生不僅在修復(fù)、生長、繁殖等過程中起著決定性作用，同時(shí)對腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移及其他許多非腫瘤疾病起至關(guān)重要的作用。VEGF-R及其配體表皮生長因子(EGF)在癌癥進(jìn)展過程中的腫瘤細(xì)胞增殖，凋亡，轉(zhuǎn)移，血管新生等過程起關(guān)鍵地位。本研究結(jié)果說明VEGF-R水平可能揭示化療療效。這與以往關(guān)于VEGF-R的研究結(jié)果相似〔5〕，VEGF-R的表達(dá)水平可能參與肺癌細(xì)胞的增殖，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為肺癌早期診斷及預(yù)后的分子標(biāo)志物。有研究報(bào)道〔6〕，血清中VEGF-R表達(dá)水平可作為一個(gè)影響肺癌進(jìn)展的重要因子。

綜上所述，動(dòng)態(tài)監(jiān)測肺癌患者血清中VEGF-R表達(dá)水平，不僅能夠較好地反映腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，可以判斷腫瘤的惡性程度，是反映淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌灶轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一，而且可作為判斷肺癌患者病情進(jìn)展的指標(biāo)，便于指導(dǎo)臨床分期、用藥及在影像學(xué)資料確診前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的早期指標(biāo)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-03-22修回〕

(編輯袁左鳴)