連 凱,葉舒揚,殷月蘭,焦新安

分子分型方法在單核細胞增生性李斯特菌流行病學研究中的應用

連 凱,葉舒揚,殷月蘭,焦新安

單核細胞增生性李斯特菌(Lm)是一種重要的食源性人獸共患病病原菌，所引起的李斯特菌病雖然發(fā)病率低，但病死率高。傳統的Lm分型方法步驟繁瑣、重復性差、分辨率低。目前，多種針對Lm的分子分型方法逐漸完善，而且分辨力、分辨率、操作性和敏感性均優(yōu)于傳統分型方法。就目前Lm分子流行病學研究中常用的分子分型方法(PFGE分型、MLVA分型、MLST分型、MVLST分型、Lineage分型)闡述、比較，為Lm食源性疾病監(jiān)測、暴發(fā)的診斷及溯源提供參考。

單核細胞增生性李斯特菌；分子分型；流行病學；李斯特菌病

李斯特菌屬(Listeriaspp.)由7個種構成,包括單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，簡稱Lm)、伊氏李斯特(L.ivanovii)、英諾克李斯特菌(L.innocua)、韋氏李斯特菌(L.welshimei)、塞氏李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、莫氏李斯特菌(L.murrayi)。其中Lm和伊氏李斯特菌均有致病性，伊氏李斯特菌主要引起動物李斯特菌病，而Lm除了感染動物外，還是引起人類李斯特菌病的主要病原菌。根據菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原的血清學反應, 將Lm分為13個血清型，分別為1/2a、1/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和7型，而95%以上的李斯特菌病是由1/2a、1/2b、l/2c和4b菌株感染所致。Lm引起的李斯特菌病具有低發(fā)病率、高致死率的特點，據統計，人李斯特發(fā)病率每百萬人在0.1～11.3例，死亡率為20%～30%[1]。新生兒、孕婦、老年人及免疫缺陷病人是李斯特菌感染的高危人群，易患腦膜炎、敗血病、流產和多器官功能障礙等侵襲性疾病[2]。近年來，因食品污染Lm而引起的食物中毒暴發(fā)事件日漸增多，已引起許多國家衛(wèi)生部門的廣泛關注。

1 Lm的流行病學

Lm在自然界中分布廣泛，存在于污泥、土壤、河水、青貯飼料中，可以在0-45 ℃、pH4.4～9.4、10%NaCl等環(huán)境中生長，對環(huán)境具有較強的抵抗力，也可寄生于昆蟲、魚、禽類及甲殼動物體內，感染的宿主多達40多種，反芻動物是其易感宿主。自然條件下，Lm可使牛、羊等動物發(fā)病，引起腦膜腦炎、流產和急性敗血癥。動物李斯特菌病主要與動物食用污染的貯存飼料有關[3]，患病動物和帶菌動物是重要的傳染源，通過糞、尿、乳汁、以及眼、鼻和生殖道分泌物排出細菌，對農場、屠宰場、污水、奶制品等造成污染[4]；并經動物制品如生肉、熟肉、生奶、酸奶、冰激淋等的加工和銷售環(huán)節(jié)，傳染給人類，導致人的李斯特菌病[5-6]。

據世界衛(wèi)生組織(WHO)統計：肉制品(30%以上)、禽產品(15%以上)、奶及奶制品(5%～10%)以及水產品(4%～8%)受到Lm不同程度的污染[7]。

中國食品中污染情況比較嚴重。在生肉、熟肉、生奶、酸奶、冰淇淋、生食水產品等樣品中都檢出了Lm[6]。國外常有由Lm引起的群發(fā)性食物中毒，其中不少為動物制品污染Lm所致。如2014年丹麥暴發(fā)了多起由香腸引起的中毒事件；2011年美國暴發(fā)了嚴重的食物中毒事件，最終發(fā)現香瓜是污染源[8]；1999-2000年間法國279人因食用凍豬舌而感染李斯特菌，其中85人死亡[9]；1995年瑞士西部暴發(fā)了一起軟質奶酪引起的中毒事件[10]。李斯特菌病呈世界性分布，對人類健康造成極大的威脅，已引起世界各國的高度重視。

2 Lm分子分型技術

由Lm引起的食物中毒事件時有報道，而有效的分型方法對于控制疾病的暴發(fā)具有至關重要的作用。傳統的表型分型方法，如血清分型、噬菌體分型等，雖然操作簡單、方便，卻不能提供菌株間足夠的相關信息，對于生化特性、血清型相同的不同菌株分辨力低。而以DNA為基礎的分子分型技術，從遺傳學的角度對細菌的流行病學規(guī)律進行研究，具有快速、準確、操作性強和分辨率高等優(yōu)點，彌補了傳統分型方法的不足，因而在食源性疾病監(jiān)測、暴發(fā)的診斷及溯源等方面得到了廣泛應用。

目前用于Lm的分子分型方法主要可以分為3類：(基于酶切技術的分型方法：擴增片斷長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、核糖體分型(Ribotyping，RT)、脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)。(基于PCR的分型方法：多位點可變數串聯重復分析(Multiple-locus Variable-number Tandem-Repeats analysis，MLVA)、分子血清分型(Molecular Serotyping)、隨機引物擴增多態(tài)性DNA分析(Random amplification of polymorphic DNA analysis，RAPD)。(基于測序技術的分型方法：多位點序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST)、多重毒力基因位點序列分型(Multi-Virulence-Locus Sequence Typing，MVLST)。

2.1 脈沖場凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE) PFGE以細菌染色體的結構特征為依據進行分型，不受表型的干擾，因其重復性好、分辨力強，被認為是分子分型的金標準，可用于大分子DNA的分離，其分辨力是傳統瓊脂糖凝膠電泳的20倍，分辨范圍可達到10 Mb[11-12]。PFGE技術是利用限制性內切酶對包裹在特殊瓊脂中細菌的進行消化，切割成大小不等的DNA片斷，然后利用脈沖場電泳將片段分離，經染色脫色后，DNA片段在凝膠上按大小呈現特異的電泳圖譜，通過軟件可對菌株間圖譜的異同以及細菌的同源性進行分析，從而為追蹤溯源提供依據。陳偉偉[13]等用PFGE對福建省不同年份、不同地點的7株Lm分離株進行分型研究，結果顯示，7株分離株分為5個型，且其中兩個菌株型別一致，均來自同一廠家生產的凍雞肉。Fugett EB[14]等采用AscI和ApaI對不用來源的Lm進行PFGE分型分析，結果顯示從洛杉磯一起暴發(fā)病例中分離到的Lm菌株與瑞士分離到的Lm菌株屬于同一型。2011年，美國暴發(fā)了一次最為嚴重的由Lm引起的食物中毒事件，Lomonaco S[8]等利用PFGE對從病人、食物和環(huán)境中分離的Lm進行分型分析，結果發(fā)現從污染香瓜中分離到的Lm與病人Lm分離株具有高度相似的帶型，提示這些暴發(fā)病例可能與被Lm污染的香瓜有關。因此，采用PFGE不僅可以有效的對食品污染進行溯源，同時還可以比較不同疾病暴發(fā)菌株間的相關性。

雖然PFGE具有較強的分辨能力，但得到的結果是DNA條帶而不是DNA序列，帶型一樣的2個菌株可能存在分子量一樣但堿基序列不同的片段，因此不能提供有意義的進化分析；操作耗時、費力，并且缺乏標準化操作規(guī)程，使得電泳帶型容易受到人為等多種因素的影響，同時不利于各實驗室間數據的交流和比較[15-16]。

2.2 多位點可變數串聯重復分析(Multiple-locus Variable-number Tandem-Repeats analysis，MLVA) MLVA是近年發(fā)展起來的以PCR為基礎的新技術，其基本原理是根據被檢測菌株基因組中不同位點可變串聯重復序列 ( variable number of tandem repeats，VNTR) 重復單元拷貝數的差異來實現對細菌的分型，主要是利用多重PCR方法對細菌染色體上多個VNTR位點進行擴增，并結合瓊脂糖凝膠電泳方法精確測定VNTR位點的重復次數，之后通過聚類軟件對不同菌株VNTR位點重復次數進行聚類分析，可將菌株分為不同的基因型，從而確定不同菌株間的親緣進化關系[17]。Murphy[18]等第一次利用MLVA對45株食源Lm分離株進行分型分析，結果顯示MLVA成功的將從熏鮭魚中分離到的Lm與其他不相關食物分離到的Lm區(qū)分開；Dass[19]等采用MLVA來追蹤一冷凍熏鮭魚加工廠中Lm的傳播，共分離到124株Lm，分為8個MLVA型(Lma、Lmb、Lmc、Lmd、Lme、Lmf、Lmg和Lmi)，且成品冷凍煙熏鮭魚中主要攜帶兩類Lm：一類來源于原材料(Lma)，另一類來自于生產加工線(Lmc)，由此表明除了生產線外，原材料攜帶的Lm也可以通過生產加工線傳播并最終導致成品冷凍熏鮭魚的污染。這些對生產企業(yè)改進衛(wèi)生狀況以減少李斯特菌污具有重要指導意義。

與其他分子分型方法相比，MLVA具有以下優(yōu)點：(實驗操作簡便，該方法是基于PCR擴增，并結合電泳進行分析，整個過程只需數小時，且可實現高通量分析；可提供完整的數字化實驗結果，便于實驗室間進行比對。且有研究發(fā)現，MLVA對于4b型菌株的分辨力明顯高于PFGE、MLST、RT，其分辨力大小關系為MLVA>PFGE>MLST>RT[20]；而在另一研究中，研究者利用MLVA、PFGE同時對121株Lm臨床分離株進行分型比較，結果顯示PFGE的分辨力比較高[19]。但是在考慮到實驗室內部進行比較的情況下，MLVA則比PFGE更為合適。雖然目前MVLA已廣泛應用于多種細菌的分型研究，但其自身仍有一些不足：MLVA的引物設計首先需要全基因組序列信息，而已公布的參考菌株的全基因組序列太少，從而較難設計出高質量特異性的引物；由于采用的儀器和電泳方法不同，導致了實驗結果間沒有可比性；MLVA實驗缺乏標準菌株的建立，無法有效簡化實驗的標準化控制，這也限制了MLVA技術在不同實驗室中的推廣應用。

2.3 多位點序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST) 1998年Maiden[21]等首次提出多位點序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST)，該技術針對的是看家基因上存在的變異位點，通過對等位基因片段(allele)核苷酸序列進行測定來鑒定變異，從而揭示菌株間等位基因的多樣性及生物間的進化關系。由于看家基因是細菌生存、繁殖所必需的，且都具有保守性，所以在長期進化過程中改變較慢、相對穩(wěn)定，因此比較適合全球流行病學研究以及不同菌株間的遺傳進化關系。所選擇的位點序列通常位于看家基因內部，長度約500 bp。經過MLST分析后，每個等位基因位點被命名為一個基因序號，這些等位基因位點的信息構成一個等位基因圖譜(allele profile)，即序列型(sequence type，ST)[21]。Salcedo等首次建立了Lm的MLST方案，確定了用于分型的7個管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA)，為了方便進行不同實驗室間數據比較，巴斯德研究所建立了專門用于LmMLST分型的數據庫(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html)。

由于等位基因之間的細微差異也會導致菌株間的ST不同，因此可通過比較每個菌株的ST型別來揭示它們之間的親緣關系，當細菌發(fā)生變異時，等位基因上多個位點的差異與單個位點差異相比具有較遠的親緣關系。Wang[22]等對中國12個省的212株Lm進行MLST分型分析，結果顯示212株菌株可分為36個ST型，其中ST9(29.1%)比較占優(yōu)勢，且均是血清型1/2c菌株；同時通過繪制最小生成樹發(fā)現，有7個ST型(ST1-ST3、ST5、ST6、ST8、ST9)在國、內外均屬于流行ST型，可引起母嬰感染或疾病暴發(fā)，提示加強對這些ST型菌株的監(jiān)控對于預防和控制李斯特菌病具有重要的指導意義。Knabel SJ[23]等利用MLST技術對71株Lm進行分析，將菌株分為17個ST型，繪制最小生成樹，并結合血清型進行分析，結果顯示共有49株菌株分布在CC8中，其中除一株菌株血清型為3a，其余菌株血清型均為1/2a。并與PFGE分型結果進行比較，認為MLST為Lm分型提供優(yōu)于血清分型和PFGE的分辨力。

MLST通過分析基因的核苷酸序列，可發(fā)現比電泳圖譜分析更多的等位基因，并通過構建進化樹來推斷不同菌株間的遺傳進化關系，從而彌補了針對基因表達產物進行分型分析的技術的缺陷。此外，與PFGE等凝膠電泳方法相比，MLST是通過測定核苷酸序列進行的，操作簡便快速，且數據易驗證、保存和共享，是標準化的技術，很好的解決了不同實驗室相互比較結果時存在的困難[24]。當然，MLST擁有諸多優(yōu)點的同時，也存在一定的局限性：該方法對于血清型為4b的菌株分辨力較低；MLST的分辨力取決于看家基因的變異情況，因此基因位點的選擇對于分辨力有著很大的影響，看家基因變異程度低或無變異的菌株不適合采用MLST；高額的費用和所需的特定儀器也是限制MLST推廣普及的原因之一[25-27]。

2.4 多位點毒力序列分型(Multi-Virulence-Locus SequenceTyping，MVLST) MVLST是一種在MLST基礎上，用進化較快的毒力和毒力相關基因代替看家基因對病原微生物進行分型分析的方法，是近年來發(fā)展較快一種新型分型技術。當需要了解Lm的地區(qū)流行狀況時，若待測菌株的看家基因序列變化較小，會導致MLST的分辨能力不足，因此不適合Lm的局部流行病學研究[28]。而Lm中的一些毒力基因和毒力相關基因經常暴露于不斷變化的環(huán)境中，與看家基因相比，進化較快，因此這些基因具有較高的核苷酸序列多態(tài)性，在地區(qū)流行病學研究中具有較強的分辨能力[29]。Zhang[28]等在研究中發(fā)現MLST不能有效地區(qū)分血清型l/2b和4b菌株，因此提出了MVLST分型技術，同時與PFGE、RT和MLST的進行比較，結果顯示MVLST對血清型為l/2a和4b的菌株分辨力較強。Rocha[30]等對從患有腦膜炎的反芻動物中分離到的21株Lm進行MVLST分型，從而檢測流行性克隆菌株，并將分型結果與人源分離株進行比對。結果顯示60%的動物源分離株分布在ECI中，而ECI又與人類李斯特菌病的暴發(fā)相關，比如，1981年加拿大暴發(fā)的病例就與羊使用的飼料有關、1985年加利福尼亞暴發(fā)病例與使用的生牛奶相關，以上研究結果揭示反芻動物攜帶的Lm會導致人李斯特菌病的流行暴發(fā)。MVLST可以將流行不相關菌株區(qū)分開，又可以將流行相關菌株聚類在一起，Yi Chen[31]等指出MVLST在研究暴發(fā)菌株間的關系時有很好的鑒別能力，因此在地區(qū)流行病學研究中，MVLST將會是一種更簡便的分型技術。

2.5 遺傳譜系分型(Lineages)Lm作為一種食源性致病菌，一旦進入動物或人體體內后，可引起嚴重的李斯特菌病，因此，為了制定有效的監(jiān)控、預防措施，需要充分的了解Lm遺傳學及生態(tài)學相關信息。早在1989年，Piffaretti[32]等報道了利用MLEE分型方法對175株不同來源的Lm進行分析，通過分析16個與代謝酶相關的等位基因的變異情況，將全部菌株分為45個ETs型，之后進行聚類分析，首次發(fā)現這些菌株可以分為兩個譜系(I和II)，其中譜系I包括血清型4b、1/2b和4a，譜系II包括血清型1/2a和1/2c；隨后Rasmussen[33]等基于flaA(flagellin)，hly，iap(p60)，23S rDNA的部分測序數據，通過毒力基因等位分析和核糖體分型發(fā)現Lm可以分為3個譜系(I、II和III)，其中譜系III由兩株血清型4a菌株構成；最近的研究中，Orsi RH[34]等對不同來源Lm的3個染色體區(qū)域進行SNP分析，包括：prfA，plcA，hly，mpl，actA，plcB，Lmo0206；Lmo0298，Lmo0299，Lmo0300；inlA，inlB。結果顯示，Lm可以分為4個譜系(I，II，III和IV)，大多數Lm分離株屬于譜系I和譜系II。譜系I包括血清型1/2b、3b、3c和4b 4種菌株，譜系II包括血清型1/2a、1/2c和3a 3種菌株，其中血清型1/2b、4b、1/2a與人李斯特菌病相關。大多數人李斯特菌暴發(fā)病例常與譜系I菌株相關，人臨床分離株中譜系I的多于譜系II；譜系II菌株在食品中占主要優(yōu)勢，存在于多樣環(huán)境中，通常從動物及散發(fā)人李斯特菌病病例中分離得到。與譜系I相比，譜系II含有更多的質粒，可以耐受有毒重金屬和細菌素。譜系II由于inlA和prfA的突變而使毒力減弱；譜系III和IV菌株則較為稀少，主要從動物中分離得到。由此可見，通過對Lm進行譜系分型分析，不僅可以促進對Lm遺傳進化方面的理解，還可以揭示不同血清型Lm在傳播以及致病力方面的不同。

3 結 語

Lm作為一種重要的人獸共患病的食源性致病菌，不僅影響人們的日常生活，甚至危及生命。由于病原微生物的表型變化落后于基因變化，因此，以表型特征為基礎的傳統分型方法，如血清分型、噬菌體分型等，已不能滿足流行病學調查的需要。而基于DNA的分子分型技術，以其快速、準確、分辨率高等優(yōu)勢，將必然取代傳統分型方法成為Lm流行病學研究的重要工具。并且隨著技術的不斷標準化和規(guī)范化，在了解菌株的親緣關系、追蹤傳染源、控制疫情的暴發(fā)和傳播等方面，分子分型技術將日益凸顯其重要作用，從而為食品安全控制帶來更多便利。

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Yin Yue-lan, Email: yylan@yzu.edu.cn

Applications of molecular typing methods to the epidemiology ofListeriamonocytogenes

LIAN Kai,YE Shu-yang,YIN Yue-lan,JIAO Xin-an

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseaseandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Listeriamonocytogenes(Lm) is a gram-positive, facultative intracellular bacterium which is widely distributed in the environment, and can infect more than 40 kinds of animal.Lmis described as an important foodborne pathogen that can cause zoonotic listeriosis, with the characteristics of low morbidity and high mortality. Traditional typing methods forLmare complex, poor repetitiveness and low-resolution. Currently, more and more molecular typing methods for discrimination ofLmare being established, they become more sensitive and discriminative compared with the phenotypic subtyping methods and are widely used for typingListeriaisolates. In this study, five common molecular typing methods (PFGE, MLVA, MLST, MVLST, Lineage) are introduced and compared, providing valuable reference for tracing the source of pathogenicLmcontamination and transmission routes.

Listeriamonocytogenes; molecular typing method; epidemiology; listeriosis

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.015

國家自然科學基金(No.31472193)；江蘇省科技支撐計劃(No.BE2012367);江蘇省自然科學基金(No.BK2011446)聯合資助

殷月蘭，Email: yylan@yzu.edu.cn

揚州大學，江蘇省人獸共患病重點實驗室，江蘇省動物主要疫病防控協同創(chuàng)新中心， 揚州 225009

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31472193), the Jiangsu Key Technology R&D Program (No. BE2012367), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK2011446)

R378

A

1002-2694(2015)08-0757-06

2014-09-10；

2015-01-26