趙 禹，孫曉林，朱興全，周東輝

頂復(fù)門原蟲棒狀體頸部蛋白研究的新進(jìn)展

趙 禹1,2，孫曉林2，朱興全1，周東輝3

頂復(fù)門原蟲是一類專一性的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲。這類原蟲具有相似的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和保守的入侵機(jī)制，入侵過程是由大量的入侵相關(guān)蛋白分子所介導(dǎo)的，包括微線體、棒狀體及致密顆粒所分泌的相關(guān)蛋白等。棒狀體分泌的頸部蛋白對蟲體入侵宿主細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，是這類寄生原蟲的毒力因子。本文綜述了頂復(fù)門原蟲棒狀體頸部蛋白的最新研究進(jìn)展。

頂復(fù)門原蟲；入侵機(jī)制；棒狀體頸蛋白

ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

1 前 言

頂復(fù)門寄生蟲種類繁多，分布全球，包括弓形蟲(Toxoplasmagondii)、隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)、瘧原蟲(Plasmodiumspp.)、巴貝斯蟲(Babesiaspp.)及艾美耳球蟲(Eimeriaspp.)等，是人和動(dòng)物的重要病原，對人類健康以及畜牧業(yè)生產(chǎn)具有嚴(yán)重危害[1-3]。這類原蟲在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上都包括有頂泡、類錐體、極環(huán)以及棒狀體、微線體等，共同形成頂端復(fù)合體，這一結(jié)構(gòu)不僅形成其分類上的結(jié)構(gòu)特征，而且使它們具有相對保守的入侵宿主細(xì)胞機(jī)制[4]。研究結(jié)果表明，入侵過程是由大量的入侵相關(guān)蛋白分子所介導(dǎo)的，包括微線體、棒狀體及致密顆粒所分泌的相關(guān)蛋白等。棒狀體是頂復(fù)門原蟲所特有的一種分泌型亞細(xì)胞器。蟲體在入侵宿主細(xì)胞時(shí)，棒狀體分泌的頸部蛋白與微線體分泌的頂膜抗原l(apical membrane antigen 1，AMAl)共同作用形成運(yùn)動(dòng)結(jié)合體(Moving Junction，MJ)，并與宿主細(xì)胞發(fā)生黏附作用，蟲體隨之慢慢進(jìn)入宿主細(xì)胞，然后形成納蟲空泡(parasitophorous vacuole，PV)。相關(guān)研究都證明棒狀體頸部蛋白和頂膜抗原一樣，對蟲體入侵宿主細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，是這類寄生原蟲的毒力因子[5-7]。

2 弓形蟲棒狀體頸部蛋白

位于棒狀體頸部的頸部蛋白R(shí)ONs，它于1980年首次在瘧原蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[8]。目前，在弓形蟲體內(nèi)已經(jīng)被證實(shí)的RONs有8種，分別為TgRON1、TgRON2、TgRON3、TgRON4、TgRON5、TgRON8、TgRON9及TgRONl0[9]。TgRONs的分泌是由微線體來調(diào)控的，并且部分TgRONs可以與一些微線體蛋白結(jié)合形成MJ，成為弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的第一步。在弓形蟲入侵過程中，微線體首先釋放出微線體蛋白，微線體蛋白的釋放會(huì)立刻觸發(fā)棒狀體分泌TgRONs。

2.1 TgRON2 在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中，TgRON2分布于弓形蟲和宿主細(xì)胞的聯(lián)結(jié)部位，并隨著入侵過程逐漸后移，直至蟲體完全進(jìn)入宿主細(xì)胞而消失。通過生物信息學(xué)和幾個(gè)跨膜區(qū)域預(yù)測軟件分析，TgRON2的N端非常多變，擁有3個(gè)推測的跨膜區(qū)域(transmembrane domain，TM)，分別是TM1(318～340aa)、TM2(1277～1296aa)和TM3(1346～1368aa)，其中TM1與其他頂復(fù)亞門相比，同源性最低，表明TM1可能并非是一個(gè)真正的跨膜區(qū)域。相反，不同頂復(fù)亞門RON2同源序列中始終能預(yù)測到TM2和TM3。利用特異抗TgRON2-4肽段(25～288aa)抗血清與宿主細(xì)胞反應(yīng)證實(shí)，TgRON2的N末端暴露在宿主細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)[10]。此外Tyler等通過免疫印跡法證實(shí)TgRON2的整個(gè)C端是AMAl和其余MJ組分連接的重要橋梁，其中C端的D3(1293～1346aa)和D4(1366～1479aa)兩個(gè)短片段分別作用于AMAl胞外區(qū)[11]，雖然TgRON2準(zhǔn)確的TM區(qū)域還有待進(jìn)一步鑒別，但是以往實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明TgRON2在宿主細(xì)胞膜的兩側(cè)均有表達(dá)，該結(jié)果為TgRON2是一個(gè)跨膜蛋白提供了有力證據(jù)。

2.2 TgRON4 TgRON4沒有推測的跨膜區(qū)域，它暴露在宿主胞質(zhì)側(cè)，與同為頂復(fù)亞門的瘧原蟲和巴貝斯蟲有同源性。Rashid等[12]通過構(gòu)建TgRON4的DNA疫苗和TgRON4重組蛋白疫苗發(fā)現(xiàn)，DNA和蛋白疫苗都能誘發(fā)體液和混合Thl/Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-5等細(xì)胞因子，但不能保護(hù)小鼠抵抗弓形蟲包囊經(jīng)灌胃途徑感染的慢性弓形蟲病。不僅如此，用福氏佐劑乳化重組TgRON4蛋白來免疫小鼠，從而獲得的抗體血清經(jīng)熱滅活后來預(yù)處理RH株速殖子，速殖子仍然能感染培養(yǎng)的細(xì)胞，這說明TgRON4的抗體不一定能抑制弓形蟲的入侵，但是顯著的Thl/Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)在抵抗弓形蟲感染中仍然很關(guān)鍵，若能加強(qiáng)宿主對TgRON4的細(xì)胞免疫反應(yīng)將使TgRON4疫苗更有效[13]。

2.3 TgRON5 起初Alexander等[14]在棒狀體蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的MJ/RON蛋白，通過質(zhì)譜分析和免疫沉淀反應(yīng)顯示，這個(gè)新蛋白相對分子質(zhì)量為110 000和45 000的2個(gè)肽段能與MJ反應(yīng)。后來，Straub等[10,15]通過孵育抗體和該蛋白的N端和C端反應(yīng)，證明這兩個(gè)片段都在胞外寄生蟲的裂解產(chǎn)物中存在，該蛋白即為TgRON5。

2.4 TgRON8 Besteiro等[5]通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)TgRON8。通過基因庫數(shù)據(jù)比對，TgRON8僅在頂復(fù)亞門中的弓形蟲、艾美爾球蟲以及新孢子蟲中發(fā)現(xiàn)，是第一個(gè)與瘧原蟲沒有同源性的MJ組分，在其他生物體內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)其同源性序列。它和AMAl/TgRON 2/4/5共同形成MJ。TgRON8大約由2 979個(gè)氨基酸組成，理論分子量為329 kDa左右，暴露在胞質(zhì)側(cè)，沒有跨膜區(qū)域。Straub等[16]通過TgRON8敲除實(shí)驗(yàn)，對MJ/RON蛋白進(jìn)行了第一次功能分析，結(jié)果顯示，缺失TgRON8的蟲體在粘附和入侵過程均有障礙，提示TgRON8有利于弓形蟲穩(wěn)定地粘附于宿主細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)其入侵。不僅如此，當(dāng)TgRON8敲除的蟲體有入侵行為時(shí)，MJ蛋白也存在分泌紊亂的現(xiàn)象，因此推測TgRON8在維持MJ的完整性以及與弓形蟲的入侵有密切關(guān)系，TgRON8的缺失不會(huì)影響弓形蟲的發(fā)育，但是卻降低了弓形蟲對宿主細(xì)胞的入侵能力以及弓形蟲在小鼠中的毒力。

2.5 TgRON9 TgRON9含有1 277個(gè)氨基酸，分子量大約為204 kDa。其N端有一段信號(hào)肽序列，C端有一個(gè)跨膜區(qū)。TgRON9在隱孢子蟲、艾美爾球蟲和新孢子蟲中存在同源基因。RON9包含一組重復(fù)富含脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸和絲氨酸或蘇氨酸的典型PEST序列。TgRON9還含有一個(gè)壽司樣結(jié)構(gòu)域(或CCP，即補(bǔ)體控制蛋白)，這是惡性瘧原蟲頂端壽司蛋白PfASP1的種間同源基因[17]。

2.6 TgRON10 TgRON10分子量大約為140 kDa，在隱孢子蟲和新孢子蟲中存在同源基因。相比于其他TgRONs，在蟲體入侵過程中，TgRON9或TgRONl0與MJ形成無關(guān)，但是TgRON9和TgRON10在弓形蟲體內(nèi)通過二硫鍵形成高度穩(wěn)定的復(fù)合物，當(dāng)棒狀體在宿主細(xì)胞中被排出時(shí)，TgRON9和TgRON10并不分泌。TgRON9或TgRONl0中任意一個(gè)基因被破壞都能引起另一方的表達(dá)障礙，并導(dǎo)致隨后的降解。如果TgRON9被敲除，會(huì)導(dǎo)致TgRON10在棒狀體內(nèi)的錯(cuò)誤定位；如果TgRON10被敲除，則會(huì)影響TgRON9分泌到棒狀體，這說明TgRON9/TgRONl0復(fù)合體的形成可能需要合適的排序。研究還發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體的缺失對棒狀體的形態(tài)、蟲體自身毒力、體外入侵及胞內(nèi)繁殖能力均無重大影響[17-18]。但其在球蟲和隱孢子蟲內(nèi)的保守性暗示了它與蟲體在腸上皮細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育有著某種特殊聯(lián)系。

2.7 其他弓形蟲棒狀體頸部蛋白 TgRON1和TgRON3通過質(zhì)譜分析被檢測到，并經(jīng)免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)其定位于棒狀體頸部，具體功能未知。

3 瘧原蟲棒狀體頸部蛋白

3.1 惡性瘧原蟲棒狀體頸部蛋白

3.1.1 PfRON2 Gardiner和Kaneko等[19-20]的研究中首次發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲中存在弓形蟲TgRON2的同源蛋白PfRON2，該蛋白基因的幾個(gè)位點(diǎn)可能由于機(jī)體免疫選擇壓力而產(chǎn)生變異，轉(zhuǎn)錄水平在成熟裂殖體時(shí)期較高，免疫電鏡證實(shí)PfRON2蛋白位于瘧原蟲裂殖子棒狀體頸部，免疫共沉淀結(jié)果也顯示PfRON2和PfAMA1以及PfRON4一起形成復(fù)合體。這些結(jié)果顯示，在惡性瘧原蟲中同樣存在PfRON2，而且和PfAMA1一起，很可能參與MJ的組成，在惡性瘧原蟲人侵紅細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵作用。

3.1.2 PfRON4 Alexander 等[21]在惡性瘧原蟲的棒狀體頸部發(fā)現(xiàn)PfRON4，而且發(fā)現(xiàn) PfRON4 蛋白可與惡性瘧原蟲PfAMA1形成復(fù)合體。因此，PfRON4蛋白很可能和 PfAMA1蛋白一起，在惡性瘧原蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中起重要作用。有研究表明PfRON4的轉(zhuǎn)錄水平在成熟裂殖子階段達(dá)到高峰，因此可能在瘧原蟲裂殖子中表達(dá)，從側(cè)面證實(shí)了 PfRON4 在惡性瘧原蟲入侵紅細(xì)胞過程有重要的作用，但其具體的生物學(xué)功能，以及其與PfRON2和PfAMA1的相互作用機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

3.1.3 PfRON6 Proellocks等[22]在惡性瘧原蟲的棒狀體頸部發(fā)現(xiàn)了PfRON6，該蛋白可能由三部分組成：一個(gè)N端重復(fù)肽段，一個(gè)亞C端保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域。它還有一個(gè)特有的N端信號(hào)序列，該結(jié)構(gòu)域有利于蛋白質(zhì)之間的相互作用[23]。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明，PfRON6定位于棒狀體頸部，在入侵時(shí)，它被釋放到PV中。編碼PfRON6的基因很難被重組，這可能暗示著它在蟲體的生命循環(huán)中起關(guān)鍵作用，同時(shí)半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域因不能被剪切，故推測其可能也具有一定的功能意義[24-25]。總之，PfRON6是惡性瘧原蟲入侵機(jī)制中一個(gè)新的可能有重要功能作用的組成部分.

3.2 間日瘧原蟲棒狀體頸部蛋白

3.2.1 PvRON1 最初選取的間日瘧原蟲PvRON1基因序列在PlasmoDB數(shù)據(jù)庫中得到。PvRON1基因有2 801個(gè)堿基；它編碼一個(gè)772個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(估計(jì)分子量84.5 kDa )，比PfASP(731aa)多41個(gè)殘基[26]。PvRON1在N末端和C末端連接著兩個(gè)分別由21個(gè)氨基酸和另一個(gè)位于第743至764之間的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)序列，這個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和GPI錨定的預(yù)測結(jié)果指出C端通過GPI錨定在這個(gè)蛋白上。此外，PvRON1與它的同源基因PfASP類似，同樣有一個(gè)壽司樣結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域由56個(gè)氨基酸組成，四個(gè)對應(yīng)的半胱氨酸通過構(gòu)象的改變來調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合或細(xì)胞粘附[27]。

3.2.1 PvRON2 Gabriela Arévalo-Pinzón等[28]的研究證明了PvRON2的存在。PvRON2含有疏水信號(hào)的氨基末端，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的羧基末端和兩個(gè)卷曲α-螺旋序列的6 615 bp的外顯子編碼的一個(gè)2 204殘基長的蛋白質(zhì)，這些都是一些先前所描述的候選疫苗預(yù)防瘧疾的特征。這種蛋白質(zhì)還包含種間可變序列內(nèi)的兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，可能參與逃避宿主的免疫系統(tǒng)，PvRON2的表達(dá)在晚期裂殖子并定位在棒狀體頸部，類似于已報(bào)道的PfRON2，這表明它參與靶細(xì)胞的侵襲過程。研究發(fā)現(xiàn)，RON2是不同瘧原蟲物種間高度保守的蛋白質(zhì)。PvRON2基因由一個(gè)單一的外顯子構(gòu)成，并在紅內(nèi)期結(jié)束時(shí)在裂殖子棒狀體中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。與PfRON2類似，PvRON2在裂殖子階段入侵宿主細(xì)胞的定位和表達(dá)扮演類似的角色[29]。

3.2.1 PvRON4 研究表明PvRON4與已報(bào)道的大多數(shù)位于頂端細(xì)胞器的蛋白質(zhì)具有類似的蛋白水解過程[30]。棒狀體蛋白的蛋白裂解在細(xì)胞表面受體或寄生蟲蛋白之間成熟或相互作用方面具有重要的作用。在弓形蟲和惡性瘧原蟲以前的研究已經(jīng)非常明確地證明RON4是在MJ中與定位有關(guān)的蛋白質(zhì)并已被選定為研究裂殖子入侵紅細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)模型[31-32]。

4 柔嫩艾美耳球蟲棒狀體頸部蛋白

戚南山等[33]通過對艾美耳球蟲基因組數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)在柔嫩艾美耳球蟲中存在TgRON2的同源蛋白EtRON2，預(yù)測其開放閱讀框(ORF)長為3 858 bp，通過上述分析研究克隆出EtRON2 長4 020 bp的ORF序列，但相對于預(yù)測序列多出162 bp，推測在拼接該序列時(shí)遺失此段外顯子，NCBI在線分析比對發(fā)現(xiàn)其與頂復(fù)門其他原蟲具有較高相似性。EtRON2基因編碼1 339個(gè)氨基酸，具有39個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，理論分子量約148 ku，等電點(diǎn)pI為8.873，是一種堿性蛋白。與弓形蟲、瘧原蟲、巴貝斯蟲的氨基酸序列進(jìn)行種系進(jìn)化分析可發(fā)現(xiàn)，EtRON2與TgRON2處于同一進(jìn)化支上，進(jìn)化關(guān)系最為接近，而其在各物種之間的相似性在15%～41%之間，說明頂復(fù)門原蟲擁有保守的RON2序列。結(jié)合弓形蟲和瘧原蟲對該蛋白功能的研究，推測該蛋白在入侵過程中發(fā)揮重要作用[34]，并且對EtRON2序列的結(jié)構(gòu)域分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，EtRON2氨基酸序列的羧基端存在一個(gè)保守的CLAG-family domain(CLAG家族結(jié)構(gòu)域)，是一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，說明EtRON2在蟲體入侵宿主細(xì)胞時(shí)確實(shí)是在膜上發(fā)揮作用[34]。

5 展 望

綜上所述，盡管人們對頂復(fù)門原蟲入侵宿主細(xì)胞的機(jī)理進(jìn)行了一些研究，發(fā)現(xiàn)棒狀體是頂復(fù)門原蟲非常重要的分泌器官，其分泌的RONs與蟲體的入侵、MJ的形成有關(guān)，作為頂復(fù)門原蟲主要的毒力因子，這些蛋白可以直接作用于宿主細(xì)胞，使其在研究新型疫苗方面有著很大的潛力。但是目前關(guān)于頂復(fù)門原蟲RONs的研究還相對較少，發(fā)現(xiàn)的頸部蛋白也為數(shù)不多。對這些蛋白在不同基因型蟲株中與宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制等也尚不明確，因此有待進(jìn)一步的深入研究。

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Zhou Dong-hui, Email: zhoudonghui@caas.cn

Research progress of apicomplexan protozoa rhoptry neck proteins

ZHAO Yu1,2,SUN Xiao-Lin2,ZHU Xing-quan1,ZHOU Dong-hui1

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,

Apicomplexan protozoa is a kind of specific intracellular parasitic protozoa. They have conserved subcelular structures and invasion mechanism. The invasion mechanisms are mediated by many invasion-associated factors, including the proteins secreted from micronemes, rhoptries and dense granules. Rhoptry secretion of neck proteins plays a key role in parasite invasion of host cell, which is a virulence factor of this kind of parasitic protozoa. In this paper, we review the latest research progress in apicomplexa rhoptry neck proteins.

apicomplexa protozoa; invasion mechanism; rhoptry neck proteins

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.017

國家自然科學(xué)基金(No.31302085，No.31172316和No.31230073)聯(lián)合資助

周東輝，Email: zhoudonghui@caas.cn

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31302085, 31172316 and 31230073)

R382

A

1002-2694(2015)08-0766-05

2014-12-14；

2015-02-22