路曉紅，付玉榮，伊正君,3

基于核酸檢測診斷結核分枝桿菌感染的研究進展

路曉紅1，付玉榮2，伊正君1,3

結核病是由結核分枝桿菌感染而引起的傳染性疾病。實驗室診斷技術的不斷進步，為結核病的診斷及治療提供了多種選擇方案。核酸檢測是利用分子生物學的理論和技術，通過直接探查核酸的存在狀態(tài)，從而對人體的狀態(tài)與疾病做出診斷的方法。近年來，核酸診斷技術的發(fā)展極大地推動了實驗室的快速診斷，本文就結核桿菌感染后細菌核酸及宿主微小核糖核酸檢測方面的新方法、新技術進行綜述。

結核分枝桿菌；分子生物學；核酸；微小核糖核酸

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2013年全球結核報告[1]，2012年新發(fā)結核病患者約860萬例，其中約130萬例患者死亡(包括32萬HIV陽性患者)。隨著HIV的流行及耐多藥結核(MDR-TB)的出現(xiàn)，結核病的控制難度不斷增加，結核病的實驗室診斷在結核病防治過程中起著至關重要的作用。目前結核病診斷的金標準仍是抗酸桿菌染色及結核桿菌培養(yǎng)，但陽性率低、時間長、延誤治療。而分子生物學新技術和新方法的不斷涌現(xiàn)，對傳統(tǒng)方法加以補充，具有靈敏度高、特異性好、檢測快速快等優(yōu)點，逐漸受到研究者和臨床工作者的青睞和重視。本文就結核桿菌感染后細菌核酸的檢測以及宿主微小核糖核酸檢測進行綜述，以期為結核病的診斷提供新的思路。

1 結核分枝桿菌核酸檢測

結核分枝桿菌是一種獨特的兼性胞內(nèi)寄生菌，能夠在巨噬細胞內(nèi)生長繁殖。結核分枝桿菌H37Rv株的全基因組已測序完成，全基因組由4 411 529 bp組成，GC堿基平均含量為65.6%，并且富含重復序列，尤其是插入序列。插入序列多數(shù)在結核桿菌中穩(wěn)定出現(xiàn)，常用于結核桿菌鑒定。多態(tài)串聯(lián)重復是結核桿菌染色體中一種主要類型的重復DNA，由10 bp的短串聯(lián)重復序列被5 bp的間隔子分隔組成。分子生物學診斷主要通過檢測患者痰液、血液、支氣管沖洗液、病變組織等部位的結核桿菌核酸、蛋白等大分子物質，來確定是否存在結核桿菌感染。當前結核桿菌核酸檢測的研究熱點主要集中在核酸靶序列的選擇以及各種聚合酶鏈反應技術的應用等方面。研究較多的靶序列主要有插入序列6110(IS6110)、MPB64基因、參與編碼L-絲氨酸脫氫酶的Rv0069c(sdaA)、Rv3133c(devR)、熱激蛋白65(HSP65)、編碼早期分泌靶抗原(ESAT-6)基因、16S rRNA、以及耐藥基因rpoB、katG、inhA、embB等。目前用于結核桿菌診斷的分子生物學方法主要有聚合酶鏈反應、基于聚合酶鏈反應的各種技術及基因芯片技術等檢測技術。

1.1 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR) 自PCR技術發(fā)明以來廣泛應用于醫(yī)學和生物學領域，并極大的推動了實驗室診斷技術的發(fā)展。PCR是在體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由變性、退火及延伸三步反應組成一個循環(huán)周期，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、速度快等特點。近幾年在PCR基礎上又發(fā)展了多種形式的PCR技術，提高結核桿菌檢測的靈敏度及特異性。

1.1.1 多重PCR(multiplex PCR)檢測技術 多重PCR是指在同一PCR反應體系中，加入兩對以上引物，擴增得到不同的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳后產(chǎn)生多條條帶。該方法特異性和敏感性均較高，且可以鑒別結核分枝桿菌復合體及非結核分枝桿菌。多重PCR可以根據(jù)需要選擇不同菌株特異性引物進行檢測，對于檢測臨床上兩種或兩種以上分枝桿菌混合性感染有重要意義。Kulkarni等[2]采用多重PCR擴增肺結核患者痰液標本中結核桿菌38 kDa基因和IS6110片段，并同時進行痰標本抗酸染色鏡顯微檢查、細菌培養(yǎng)、及單基因PCR等檢測，結果顯示兩種目的基因的多重PCR敏感度(81.7%)高于痰培養(yǎng)(69.2%)和抗酸染色法(53.3%)，在細菌培養(yǎng)陽性的標本中多重PCR的靈敏度較單基因PCR高。多重PCR提高了單基因PCR的敏感度，對于診斷涂陰樣本十分有用。此外，這種方法還可以檢測出IS6110缺失型菌株。Sharma等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在確診結核組中以IS6100和devR作為引物進行多重PCR檢測的陽性率為97.5%，而以IS6100作為引物的單純PCR陽性率為84.5%；在臨床疑似結核組中，多重PCR和PCR的陽性率分別為45%和40%。Chia等[4]設計了一種改良的多重PCR，使用包括16S-23SrDNA的內(nèi)部轉錄間隔區(qū)-1、熱休克蛋白65和編碼ESAT-6等基因的9對引物靶標，與傳統(tǒng)培養(yǎng)和16SrRNA基因測序相比較，多重PCR的靈敏度及特異度均較高，并建議將改良的多重PCR在結核病高流行國家應用。Vadwai等[5]采用多重PCR通過檢測katG315、rpoB531、gyrA94及rrs1401位點的突變來確定結核桿菌對異煙肼、利福平、氟喹諾酮類和氨基糖苷類藥物的敏感性，結果顯示多重等位基因特異PCR在細菌培養(yǎng)陽性的患者檢測準確率為97.2%，培養(yǎng)陰性的患者檢測準確率為93.6%，涂陽患者檢測準確率為100%和涂陰患者檢測準確率為55.5%。其不足之處主要在于引物的設計及反應條件的優(yōu)化存在，需要不斷調整反應條件以至所有引物對擴增出目的條帶。

1.1.2 實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)技術 實時熒光定量PCR擴增時加入一對引物和一個特異性的熒光探針，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時PCR技術能夠有效解決PCR污染問題、且自動化程度高。Richardson 等[6]建立了多重實時定量PCR，即多重PCR和實時定量PCR技術相結合，他們采用此技術對314例臨床標本分離株進行檢測，結果顯示其敏感度和特異度達到99%，且因為應用多對特異性引物，可快速對分枝桿菌進行分型。Kim等[7]首次報道利用多重實時熒光PCR可鑒別出20種分枝桿菌，利用多對不同引物及特異的探針逐步檢測出各種分枝桿菌菌株，非常適用于非結核分枝桿菌的鑒定。Bainomugisa等[8]利用羅氏公司LightCycler 480 PCR儀進行實時熒光定量PCR來檢測結核分枝桿菌及鳥分枝桿菌，結果顯示結核桿菌及鳥分枝桿菌的檢測靈敏度達到100%，特異度分別為99%和95%。Darban-Sarokhalil等[9]利用實時定量PCR技術擴增呼吸道標本中的結核桿菌cyp141基因，結果顯示其總敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為90.2%、97.8%、97.1%和92.3%，并且其敏感度、特異度與Xpert MTB/RIF試劑盒檢測相當，研究還顯示其與結核桿菌分型存在相關性，提示cyp14可以作為結核定量檢測的靶標。Riahi[10]等利用實時定量PCR檢測利福平耐藥性的敏感度及特異度可達到100%，提示其可用于利福平耐藥的檢測。

1.2 RNA恒溫擴增實時檢測(simultaneous amplification and testing, SAT) SAT是基于RNA恒溫擴增技術發(fā)展起來的一項最新核酸檢測技術，是國內(nèi)自主專利技術[11]。該技術是核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術。SAT基本原理是：在同一溫度下，首先通過M-MLV反轉錄酶產(chǎn)生靶標核酸RNA的1個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個RNA拷貝，每個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)，同時帶有熒光標記的探針與RNA拷貝特異結合產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光信號來反應目標RNA的含量。此實驗檢測的底物是RNA，由于RNA容易降解，可減少其他核酸的污染。檢測結果可區(qū)分死菌、活菌，更利于用藥后療效的監(jiān)測，以及對是否治愈進行判斷。Cui等[12]利用SAT技術以結核桿菌16S rRNA為靶標檢測253例肺結核標本和134例非結核標本，SAT檢測與Bactec MGIT 960培養(yǎng)的符合率為95.6%。SAT對肺結核檢測的敏感度、特異度、陽性預測值及陰性預測值分別為67.6%、100%、100%和62.0%。程松等[13]以pre-16S rRNA為檢測靶標設計RNA探針及帶有T7啟動子的逆轉錄擴增引物，42℃擴增實時檢測在藥物作用下pre-16S rRNA的變化，以Bactec MGIT 960為判定標準時，SAT檢測利福平耐藥株的敏感度為100%、檢測敏感株的特異度為97.4%、陽性預測值及陰性預測值分別為96.2%和100%。

1.3 環(huán)介導等溫擴增法 (loop mediated isothermal amplification, LAMP) 環(huán)介導等溫擴增技術是針對靶基因的6個特異部位設計4個引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶基因高效擴增。LAMP能夠在等溫條件下直接擴增臨床標本中的結核桿菌DNA，不需要擴增儀，可肉眼直接觀察結果，整個過程約需2 h。Bi等[14]進行的以hsp X基因為靶標的LAMP法檢測可準確鑒別出不同的結核桿菌及非結核分枝桿菌，并且此實驗可在27 min內(nèi)完成，有望成為結核病高負擔的發(fā)展中國家結核病的診斷方法。Li[15]等將管家基因Rv2461c作為LAMP擴增的靶標檢測126份臨床痰標本，結果顯示其敏感度和特異度分別為84.8% 及95.7%，提示Rv2461c可作為結核桿菌核酸檢測的新靶標。Kumar等[16]針對結核分枝桿菌早期分泌蛋白east-6基因設計3對引物進行LAMP擴增，其檢測效率高于培養(yǎng)法，特異性與PCR相當，但其速度更快且費用低。但其對引物的要求特別高，擴增產(chǎn)物只能用于判斷，并且特別容易形成氣溶膠，造成假陽性。

1.4 單鏈構象多態(tài)性分析(single-strand conformation polymorphism，SSCP) SSCP技術是檢測核酸單堿基突變可靠而簡便的方法。其原理為DNA產(chǎn)物為兩條互補單鏈，各單鏈的堿基序列的差異將形成不同的構象，即使是單個堿基發(fā)生突變亦可形成不同的空間構象，導致電泳的遷移率改變，在凝膠上亦會顯示不同的帶型以確定有無突變。將待測菌株的帶型與結核標準株進行比較，即可判定待測菌株是否存在突變。一項meta分析[17]顯示應用PCR-SSCP快速檢測利福平耐藥的敏感度為79%，特異度為96%，陽性似然比為16.10，陰性似然比為0.20，提示該法適用于利福平年耐藥的快速診斷。很多文獻報道關于PCR-SSCP用于結核桿菌基因突變和耐藥性的快速檢測[18-20]。采用PCR-SSCP 技術分析MDR-TB的耐藥機理已成為研究熱點。檢測耐藥基因有很強的特異性和較高的敏感性，與常規(guī)耐藥性測定方法有很高的符合率，又可同時分析多個樣本，很適用于臨床檢測。但該法只能用于確定有無基因突變而不能確定突變的部位和性質。

1.5 基因芯片(Gene Chips) 基因芯片的基本原理是將大量已知序列的寡聚核苷酸探針固定于支持物上，然后與待測樣本的DNA或RNA進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息?；蛐酒赏瑫r完成對樣品多個序列的檢測和分析，具有快速、高效的優(yōu)點，可用于診斷分枝桿菌混合感染等復雜病例。芯片技術在檢測結核桿菌、菌種鑒定、研究耐藥基因以及基因組比較分析等方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿Αhang[21]等針對結核桿菌的13種特異的靶基因設計基因芯片用于臨床標本的快速檢測，其檢測的陽性率為85%，并且可以檢測出不同的亞種。Shi等[22]采用基因芯片法對臨床分離菌株進行菌種鑒定及耐藥性測定，檢測出44株結核桿菌及10株非結核桿菌株，異煙肼耐藥2株，利福平耐藥1株，異煙肼和利福平均耐藥1株。 Pang[23]等從多方面評價基因芯片技術在耐多藥結核診斷中的價值，結果顯示基因芯片檢測利福平耐藥的敏感度及特異度分別為87.56% 及97.95%，檢測異煙肼耐藥的敏感度及特異度分別為80.34% 和95.82%，其檢測效果優(yōu)于傳統(tǒng)藥敏試驗，并且高效、快速及安全。Zimenkov等[24]針對基因gyrA、gyrB、rrs及 eis 啟動子區(qū)域序列設計寡核苷酸微陣列來檢測泛耐藥結核(Extensive Drug Resistant TB, XDR-TB)，氟喹諾酮耐藥檢測敏感度為98%、特異度為100%，卡那霉素耐藥檢測敏感度為97%、特異度為94%，鏈霉素耐藥檢測敏感度為100%特異度為94%。但基因芯片制作復雜，需要昂貴的特殊儀器，因而限制了它在臨床應用的普及。

2 宿主微小核糖核酸(micro RNA, mi RNA)檢測

miRNA是一類存在于真核細胞中的非編碼小RNA，可以調控基因轉錄后表達。最近研究發(fā)現(xiàn)，結核桿菌感染宿主后引起宿主miRNA產(chǎn)生一系列變化，并且miRNA在結核感染的不同階段表達類型及含量亦會隨之改變，隨著對miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在機體抗結核免疫反應中具有重要作用。miRNA種類及含量的變化可能提示結核感染的不同狀態(tài)，例如能夠鑒別潛伏性結核感染與活動性肺結核等，因此miRNA有望成為結核感染新的檢測靶點。

潛伏性結核感染 (latent tuberculosis infection, LTBI) 通常是指宿主感染結核桿菌，皮膚結核菌素試驗呈陽性，但未出現(xiàn)活動性結核的臨床癥狀及影像學改變。Wang等[25]利用miRNA微陣列檢測潛伏性結核感染者、活動性肺結核患者和正常人群miRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)LTBI患者組血清中的 miR-130b*、miR-342-5p、miR-155、miR-181b、miR-548b-3p表達顯著低于活動性結核組及正常對照組。有研究發(fā)現(xiàn)活動性肺結核患者的血清及痰液等標本的中存在miRNA的差異表達。Fu等[26]首次采用miRNA芯片技術檢測活動性肺結核患者與正常人群的循環(huán)miRNA。該研究顯示活動性結核患者血清中有92個miRNA變化顯著，59個miRNA表達下調，33個miRNA表達上調。當用qRT-PCR進行驗證時發(fā)現(xiàn)，miR-3125 在血清中低表達；miR-29a在血清及痰液標本中表達均升高；miR-93*在患者血清中高表達，在痰液中表達與正常組無顯著性差異。Yi等[27]采用芯片技術篩選出活動性肺結核患者的痰液上清中差異表達的miRNA，與健康對照組相比，結核病患者痰液中發(fā)現(xiàn)95個差異表達的miRNA，miR-3179和miR-147過表達，miR-19b-2*表達降低。因此，有望把循環(huán)miRNA作為活動性結核診斷的生物標志物及生物治療的靶點。Wu等[28]利用結核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)對活動性肺結核患者的外周血單個核細胞進行誘導，miRNA微陣列進行檢測，并采用RT-qPCR進行定量分析，結果顯示miR-155和miR-155*的含量顯著高于正常對照組。提示miR-155和miR-155*可能成為結核桿菌感染的新的診斷標記。

3 結 語

結核病仍舊是一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病，結核病的防治工作任重而道遠。分子生物學診斷技術具有靈敏度高、特異性強、速度快等優(yōu)點，在結核分枝桿菌診斷領域具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。目前很多檢測技術及方法正處于由實驗室轉向臨床應用的過渡階段，同時也面臨諸多問題，如需要精密儀器，操作者需要進行專業(yè)培訓，存在一定的假陽性率等問題。結核桿菌的核酸檢測與宿主miRNA檢測相結合或許能夠準確地確定病原菌，又能夠提示患者結核感染的不同階段，為臨床結核病的早診斷，早治療及優(yōu)化治療方案提供有價值的參考。同時，特異的結核桿菌核酸及宿主miRNA有待進一步挖掘，以期為臨床的診斷及治療提供有價值的指標。

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Research progress in molecular biological diagnosis of tuberculosis infection

LU Xiao-hong1,FU Yu-rong2,YI Zheng-jun1,3

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;2.DepartmentofMedicalMicrobiology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;3.TheAffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261031,China)

Tuberculosis is an infectious disease caused byMycobacteriumtuberculosis. The rapid development of laboratory diagnostic technology provides a variety of options for diagnosis and treatment of tuberculosis. Nucleic acid detection is to use the theory and technology of molecular biology, through direct detection of status or defect of particular segments, then make diagnosis of the state of human body and disease. In recent years, the development of nucleic acid diagnostic technique has greatly promoted the rapid diagnostic of laboratories. This article reviews the new methods of bacterial nucleic acid and host microRNAs detection technologies.

Mycobacteriumtuberculosis; molecular biology; nucleic acid; micro RNA

Yi Zheng-jun, Email:fuyizhengjun@163.com

國家自然科學基金資助(No.81470001;No. 30972639)

伊正君，Email:fuyizhengjun@163.com

1.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學系，濰坊 261053； 2.濰坊醫(yī)學院病原生物學教研室，濰坊 261053； 3.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科 ，濰坊 261053

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.015

R378.91

A

1002-2694(2015)10-0967-05

2015-05-04；

2015-07-26

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81470001 and 30972639)