孫曉勉，陸 洋，黃旭麗

(1.深圳市福田區(qū)婦幼保健院兒保科，廣東 深圳 518000：2.南華大學(xué)研究生院，湖南 衡陽(yáng) 421000)

深圳市福田區(qū)新生兒聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查分析

孫曉勉1，陸 洋2，黃旭麗1

(1.深圳市福田區(qū)婦幼保健院兒?？疲瑥V東 深圳 518000：2.南華大學(xué)研究生院，湖南 衡陽(yáng) 421000)

目的 采用物理測(cè)聽和飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)福田區(qū)所屬4家醫(yī)院產(chǎn)科出生的所有新生兒進(jìn)行聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查，階段性分析在深圳市新生兒中普遍進(jìn)行聽力和耳聾基因聯(lián)合檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 在深圳市福田轄區(qū)4家醫(yī)院產(chǎn)科中，經(jīng)新生兒監(jiān)護(hù)人的知情同意，采集2014年7月至12月出生的新生兒足底血4 972份，提取全基因組DNA，用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)中國(guó)人群中常見的4個(gè)耳聾相關(guān)基因的20個(gè)突變位點(diǎn)，包括GJB2基因(35delG、167delT、176-191dell6、235delC、299-300delAT)，GJB3(538CA>T、547G>A)，SLC26A4(281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVSl5+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G)，線粒體12SrRNA(1494C>T、1555A>G)。同時(shí)進(jìn)行聽力篩查，聽力初篩采用耳聲發(fā)射(OAE)，復(fù)篩用OAE結(jié)合聽性腦干反應(yīng)(ABR)。結(jié)果 4 972例中聽力初篩未通過(guò)199例，占總數(shù)的4%，復(fù)篩時(shí)未通過(guò)13例，占0.3%；4 972例新生兒檢測(cè)出GJB2基因c.235delC、c.176del16和c.299-300delAT，35delG四種突變共90例；SLC26A4基因1174A>T、1226G>A、2168A>G、IVS7-2A>G突變74例；GJB3基因突變17例；線粒體12SrRNA基因m.1555A>G突變16例，線粒體12SrRNA基因m.1494C>T突變1例。GJB2基因299-300delAT、SCL26A4基因IVS7-2AG復(fù)合雜合突變，GJB2基因235del、12SrRNA1555AG復(fù)合雜合突變、GJB3基因538CT、SLC26A4基因IVS7-2AG復(fù)合雜合突變分別各1例。結(jié)論 福田區(qū)沒(méi)有耳聾家族史的新生兒中，GJB2基因的雜合突變率高于SLC26A4基因突變率，GJB3基因和線粒體12SrRNA基因突變較為少見，遺傳性耳聾基因檢測(cè)技術(shù)在新生兒篩查中具有很重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)新生聾兒的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療具有較重要的作用。

新生兒；聽力篩查；耳聾基因；聯(lián)合篩查

聾病是人類最常見的感覺(jué)功能障礙，是影響人類健康和造成人類殘疾的常見原因，也是臨床常見的遺傳病之一[1]。2006年中國(guó)第2次殘疾人抽樣調(diào)查顯示，現(xiàn)有聽力殘疾者達(dá)2 780萬(wàn)人，位居各類殘疾性疾病之首(占28%)，其中7歲以下的聾兒達(dá)80萬(wàn)人，并以每年新增3萬(wàn)聾兒的速度在增長(zhǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每1 000名新生兒中，就有1～3例聽力障礙兒童，其中至少一半與遺傳因素有關(guān)[2]。

遺傳性耳聾分為非綜合征型和綜合征型兩種類型，我國(guó)人群的大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明，大部分的非綜合征型耳聾由幾個(gè)基因的突變引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)和線粒體DNA 12SrRNA基因[3]。

本研究采用快速、高通量的飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)4 972例新生兒進(jìn)行4個(gè)耳聾相關(guān)基因的20個(gè)常見的突變位點(diǎn)篩查，以實(shí)現(xiàn)對(duì)聾兒的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，降低新生兒聾病的發(fā)生率。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014年7月至12月在福田區(qū)4家醫(yī)院產(chǎn)科出生，Apgar評(píng)分8～10分，無(wú)產(chǎn)科合并癥，母嬰同室的全部符合條件的新生兒4 972例為研究對(duì)象。孕周37～40周，體重2 350～3 760g，孕母妊娠期有特殊用藥及聽力損害家族史除外。其中男2 913例，女2 059例，男女比例1.41:1，均為漢族。

1.2 方法

1.2.1 聽力篩查方法

聽力初篩采用畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(OAE)，復(fù)篩采用OAE結(jié)合聽性腦干誘發(fā)電位(ABR)。初篩時(shí)間為出生后3～5天，復(fù)篩為出生后42天，復(fù)篩未通過(guò)的患兒于生后3個(gè)月時(shí)行聽力學(xué)評(píng)估和診斷。

1.2.2 聽力診斷方法

根據(jù)患兒具體情況，采用聽性腦干反應(yīng)、聽性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)、聲導(dǎo)抗等，部分行顳骨CT掃描或核磁共振檢查。

1.2.3 聾病易感基因篩查方法

1.2.3.1 標(biāo)本采集 經(jīng)新生兒監(jiān)護(hù)人書面知情同意后，由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的護(hù)理人員采集新生兒足跟血，置于采血濾紙片上，晾干后0～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 基因檢測(cè) 抽提基因組DNA的血樣，送到華大基因?qū)嶒?yàn)室，利用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，簡(jiǎn)稱MALDI-TOFMS)技術(shù)對(duì)耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)[4]。MALDI-TOFMS技術(shù)的主要特點(diǎn)是，將制備的樣本分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管，而后用瞬時(shí)納秒(10～9s)強(qiáng)激光激發(fā)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會(huì)解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場(chǎng)中獲得相同的動(dòng)能，進(jìn)而在一非電場(chǎng)漂移區(qū)內(nèi)按照其質(zhì)荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達(dá)檢測(cè)器。根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)離子。即行耳聾易感基因GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、線粒體12SrRNA基因的20個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)。

1.3 隨訪

對(duì)于聽力篩查和基因篩查結(jié)果異常者定期對(duì)其聽力情況、語(yǔ)言發(fā)育情況、干預(yù)情況等進(jìn)行隨訪并給預(yù)防聾指導(dǎo)。

2 結(jié)果

2.1 聽力篩查結(jié)果

4 972例新生兒中，初篩耳聲發(fā)射檢測(cè)通過(guò)4 773例，未通過(guò)199例，初篩未通過(guò)率4.06%，3 025例同時(shí)接受了聽性腦干復(fù)測(cè)，未通過(guò)13例。

2.2 聾病易感基因的檢測(cè)結(jié)果

4 972例新生兒中進(jìn)行了聾病易感基因的篩查，結(jié)果異常的有201例，總體陽(yáng)性率為4.05%，各基因組檢出率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，χ2=1.525，P=0.000<0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明4個(gè)基因的檢出率之間有差別。異?；蚍植记闆r見表1。其中199例聽力初篩未通過(guò)的新生兒中，聾病易感基因的篩查結(jié)果異常的有99例，耳聾基因總陽(yáng)性率為49.7%(99/199)、致病突變率10.1%(20/199)、雜合攜帶率61.3%(122/199)，4 773例聽力初篩通過(guò)新生兒中聾病易感基因的篩查，結(jié)果異常的有102例，耳聾基因總陽(yáng)性率2.13%(102/4 773)，致病突變率0.29%(14/4 773)，雜合攜帶率1.66%(79/4 773)。

從4個(gè)基因各位點(diǎn)的比較得出本人群的突變形式有GJB2基因有235delCA、299-300delAT、176-191del16、35delG突變，SLC26A4位點(diǎn)有IVS7-2AG、1174AT、2168ACT、1226GT突變，12SrRNA的位點(diǎn)有1494CT純合突變、1555AG純合突變，GJB3基因有538CT和547GA位點(diǎn)雜合突變?？傊虏⊥蛔償y帶率為4.05%，從高到低的排位是GJB2235delCA(1.37%)、SLC26A4IVS7-2AG(0.95%)、12SrRNA1555AG(0.32%)、GJB3538CT(0.18%)、547GA(0.16%)。

(轉(zhuǎn)下表)

(續(xù)上表)

2.3 聾病易感基因突變與性別的關(guān)系

2 913例男性新生兒中出現(xiàn)耳聾易感基因突變123例，突變攜帶率4.22%，2 059例女性新生兒中出現(xiàn)耳聾易感基因突變78例，突變攜帶率為3.79%，比較男女兩組間聾病易感基因突變攜帶率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.586，P=0.444>0.05)。

2.4 聾病基因突變與孕母年齡的關(guān)系

將孕母按照妊娠年齡分為20～<25歲；25～<30歲；30～<35歲；35～<40歲；40歲及以上4組，比較各組間新生嬰兒聾病易感基因突變攜帶率差異，結(jié)果顯示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.252，P=0.373>0.05)，見表2。

表2 不同妊娠年齡孕母所生新生兒聾病易感基因突變攜帶率比較

Tabel 2 Comparison of susceptibility gene mutation carrier rate of deaf disease among newborns of women with different maternal gestational age

3 討論

3.1 新生兒聽力及耳聾基因聯(lián)合篩查的臨床意義

耳聾是臨床上最常見的遺傳病之一，有60%的耳聾是由遺傳缺陷引起的[5]，而且在大量的遲發(fā)性聽力下降患者中，亦有許多患者也是由于自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對(duì)致聾環(huán)境因素易感性增加而致病[6]。目前，我國(guó)各省市正在普及采用物理方法來(lái)進(jìn)行新生兒聽力篩查，但隨著聽力篩查的逐漸普及，臨床也開始發(fā)現(xiàn)這一物理篩查方法的不足，如對(duì)遲發(fā)性耳聾和藥物性耳聾的漏檢，對(duì)先天性耳聾的確診需要經(jīng)過(guò)多次隨訪，到2歲前后才能給出確切的結(jié)論，不能及早采取干預(yù)措施，錯(cuò)過(guò)了孩子語(yǔ)言培訓(xùn)的最佳時(shí)機(jī)，甚至導(dǎo)致由聾致啞。

王秋菊等于2007年提出，在新生兒聽力篩查中注入基因篩查的理念，實(shí)施新生兒的聽力及基因的同步篩查是目前作為早期發(fā)現(xiàn)處于語(yǔ)前聽力損失或遲發(fā)型高?；純夯蛘呤侵旅@基因的攜帶者最為有力的篩查策略。

本次檢測(cè)耳聾基因總陽(yáng)性率為4.05%，聽力初篩未通過(guò)新生兒耳聾基因總陽(yáng)性率、致病突變率、雜合攜帶率均明顯高于聽力初篩通過(guò)新生兒，提示可將聽力初篩未通過(guò)新生兒作為目標(biāo)人群進(jìn)行常見耳聾基因篩查。但在本研究中，通過(guò)聽力篩查的新生兒中檢測(cè)到了致病突變201例，特別是有17例是藥物性耳聾相關(guān)基因和17例可能導(dǎo)致遲發(fā)性的，通過(guò)基因檢測(cè)，進(jìn)行早期預(yù)警可避免藥物性耳聾發(fā)生，對(duì)遲發(fā)性聽力損失可進(jìn)行早期干預(yù)。

3.2 異常耳聾基因攜帶者基因類型分布

我國(guó)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查(2007年)顯示，21%的耳聾患者帶有GJB2基因突變，14.5%的患者帶有SLC26A4基因突變，3.8%和0.6%的患者分別帶有mtDNAA1555G和C1494T突變。

GJB2是引起非綜合性遺傳性耳聾最常見的聾病基因[7]，突變類型中主要235delC、299-300delAT、176-191del16[8]。本研究檢測(cè)結(jié)果中GJB2基因5個(gè)位點(diǎn)異常共有90例，占1.81%，攜帶率最高，突變也集中在235delC、299-300delAT、176-191del16這3個(gè)位點(diǎn)，還檢測(cè)到1例35delG突變，未檢測(cè)到167delT突變，檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的相似。因GJB2基因相關(guān)耳聾患者的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量正常，適合人工耳蝸植入，該類患者在人工耳蝸植入后語(yǔ)言理解能力強(qiáng)，故明確GJB2基因突變致聾對(duì)治療和預(yù)后有重要意義。

Dai等(2009年)研究認(rèn)為SLC26A4基因是僅次于GJB2突變而引起感音神經(jīng)性聾的遺傳學(xué)病因，本研究中SLC26A4基因突變陽(yáng)性率為1.49%，在4個(gè)基因中突變陽(yáng)性率位于第2位，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。SLC26A4基因突變與大前庭水管綜合征有密切關(guān)系[10]，凡是引起顱內(nèi)壓變化的因素如輕度的頭部碰撞、重度感冒等均能引起大前庭水管綜合征患兒的聽力下降及時(shí)檢測(cè)出SLC26A4基因突變可以指導(dǎo)患者在日常生活中避免激烈運(yùn)動(dòng)，顱腦外傷等環(huán)境因素導(dǎo)致遲發(fā)性的進(jìn)行性聽力下降。及時(shí)發(fā)現(xiàn)病因，提示加強(qiáng)日常防護(hù)對(duì)避免或延緩患兒聽力損失甚為重要。

線粒體DNA 12SrRNA是最為常見的后天性氨基糖苷類藥物所致的藥物中毒性耳聾的原因之一[11]。A1555G突變?cè)诎被擒疹惪股厥褂檬仿犃φ系K患者中的發(fā)病率較高，氨基糖苷類抗生素使用史聽力障礙患者中可以發(fā)現(xiàn)13%～33%的患者有A1555G突變，本研究17名通過(guò)聽力篩查的新生兒中檢測(cè)到線粒體DNA 12SrRNA1555AG純合突變16例，1例DNA 12SrRNA1494CT純合突變，均為致病突變，雖全部通過(guò)了聽力篩查，但如果以后使用氨基糖苷類抗生素，可出現(xiàn)“一針致聾”的后果。告知家長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果，提示對(duì)這17名嬰兒應(yīng)高度預(yù)警，避免使用此類耳毒性藥物，基因檢測(cè)讓這些患兒終生受益。同時(shí)，由于線粒體DNA為母系遺傳，此基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)家系中所有母系成員均可起到預(yù)警的作用。

GJB3基因是我國(guó)本土克隆和鑒定的第1個(gè)耳聾致病基因，可引起常染色體顯性或隱性遺傳性非綜合征性耳聾，被認(rèn)為與高頻聽力下降有關(guān)[12]。本研究共檢出17例GJB3雜合突變，該17例嬰兒42d時(shí)經(jīng)DPOAE和ABR篩查均顯示通過(guò)，對(duì)這些嬰兒應(yīng)定期進(jìn)行聽力學(xué)監(jiān)測(cè)，以早期發(fā)現(xiàn)聽力損失早期干預(yù)。

3.3 聾病易感基因與性別及母親生育年齡無(wú)關(guān)

本研究比較聾病易感基因攜帶的男女性別差異及孕母不同年齡生產(chǎn)的新生兒聾病易感基因攜帶狀況，均未顯示明顯差異，與有資料顯示聾病易感基因攜帶存在男性多于女性的差異不同。說(shuō)明不同性別、區(qū)域及各個(gè)年齡段母親所生新生兒均有進(jìn)行聾病易感基因篩查的必要性。

綜上所述，在現(xiàn)行聽力篩查基礎(chǔ)上聯(lián)合開展聾病易感基因普遍篩查，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)常見耳聾相關(guān)基因熱點(diǎn)突變檢出率較高、結(jié)果準(zhǔn)確，具有快速、高通量、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，能夠滿足臨床耳聾基因檢測(cè)的要求，應(yīng)用于新生兒篩查，能夠有效檢出攜帶者及耳聾患兒，對(duì)遺傳性聾高危兒童及時(shí)進(jìn)行聽力學(xué)監(jiān)控和隨訪，對(duì)藥物中毒性耳聾高危兒童進(jìn)行終生用藥指導(dǎo)、生活行為指導(dǎo)，進(jìn)行人工耳蝸植入手術(shù)療效預(yù)測(cè)、遺傳咨詢和生育指導(dǎo)，對(duì)完善防聾治聾策略，降低遺傳性聾的發(fā)病率，致殘率意義重大。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：劉黎明]

Hearing screening combined with deafness gene screening in newborns in Futian District

SUN Xiao-mian1, LU Yang2, HUANG Xu-li1

(1.DepartmentofChildHealth,ShenzhenMaternalandChildHealthCareHospital,GuangdongShenzhen518000,China; 2.UniversityofSouthChina,HunanHengyang421000,China)

Objective To perform hearing and deafness genes combined screening for all newborns born in four maternity hospitals in Futian District by using time of flight mass spectrometry (TOF-MS) detection and physical audiometry technology and to conduct periodic analysis of clinical applications of hearing and deafness genes combined detection in newborns in Shenzhen. Methods In four maternity hospitals in Futian District, 4 972 planta blood samples of newborns were collected during July to December in 2014 with guardian consent, and whole genomic DNA was extracted. TOF-MS was used to detect 20 mutation sites in four common deafness genes of Chinese population, including GJB2 gene (35delG, 167delT, 176-191dell6, 235delC, 299-300 delAT), GJB3 (538CA>T, 547G>A), SLC26A4 (281C T, 589G>A, IVS7-2A>G, 1174A >T, 1226G>A, 1229C>T, IVSl5+5G>A, 1975G>C, 2027T>A, 2162C>T, 2168A>G), mitochondria 12SrRNA (1494C>T, 1555A>G). At the same time hearing screening was performed with otoacoustic emission (OAE) and combining OAE with auditory brainstem response (ABR) for secondary screening. Results Of 4 972 patients 199 cases (4%) did not pass hearing screening and 13 cases (0.3%) did not pass secondary screening. Ninety cases were found with GJB2 gene c.235delC, c.176del16, c.299-300delAT and 35delG mutation, 74 cases were found with SLC26A4 gene 1174A>T, 1226G>A, 2168A>G, IVS7-2A>G mutation, 17 cases with GJB3 mutation, 16 cases with mitochondrial gene 12SrRNA m.1555A>G mutation, and one case with mitochondrial gene 12SrRNA m.1494C>T mutation. GJB2 gene 299-300delAT, SCL26A4 IVS7-2AG compound heterozygous mutation, GJB2 gene 235del, 12SrRNA1555AG compound heterozygous mutation, GJB3 gene 538CT, and SLC26A4 gene IVS7-2AG compound heterozygous mutation were found in 1 case, respectively. Conclusion Of the newborns without family history of deafness in Futian District, heterozygous mutation rate of GJB2 gene is higher than mutation rate of SLC26A4 gene, and gene mutations of GJB3 gene and 12SrRNA mitochondrial gene are rare. Genetic testing technology for hereditary deafness in newborn screening is very important in clinics, which is essential to early detection and early treatment of newborn deafness.

newborns; hearing screening; deafness gene; combined screening

2015-05-22

深圳市科創(chuàng)委知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：JCYJ20140415094713859)

孫曉勉(1961-)，女，主任醫(yī)師，主要從事兒童保健工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.004

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