熊愛為，謝靜燕

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院婦科，江蘇 南京 210006)

【婦幼綜合研究】

Notch信號通路及其在卵巢癌細(xì)胞中的作用

熊愛為，謝靜燕

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 南京市第一醫(yī)院婦科，江蘇 南京 210006)

Notch是一條進(jìn)化上高度保守的跨膜受體家族，通過對Notch信號通路下游胞內(nèi)活性成分(NICD)的激活來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和分化，影響細(xì)胞耐藥特性。Notch通過與不同配體結(jié)合，在不同細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮不同作用，提示其通路活化的多樣性。該文主要對Notch信號通路通過不同配體結(jié)合激活NICD而發(fā)揮不同的作用進(jìn)行綜述。

Notch信號通路；卵巢癌；增殖；分化

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的疾病，病死率位于婦科腫瘤首位。卵巢癌有70%發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，且Ⅲ期或Ⅳ期的5年生存率仍維持在20%～40%之間。目前對卵巢癌的經(jīng)典治療方案仍為手術(shù)加術(shù)后化療，而以鉑類與紫杉醇為基礎(chǔ)的化療方案術(shù)后復(fù)發(fā)率高是導(dǎo)致卵巢癌患者5年生存率低的重要原因。據(jù)研究，19%的早期卵巢癌及60%～85%的晚期卵巢癌會復(fù)發(fā)。近來發(fā)現(xiàn)，Notch在卵巢惡性細(xì)胞中異常表達(dá)，Notch信號通路下游分子參與到了卵巢癌細(xì)胞對鉑類或者紫杉醇類化療藥物耐藥、卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡等過程[1-3]，提示其與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)。

Notch是一個(gè)高度保守的跨膜受體家族，廣泛存在于無脊椎和脊椎動物體內(nèi)。1917年Morgan在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Notch基因，因其突變可致果蠅殘翅(Notch ES)得名。近年來研究表明Notch通路廣泛存在于卵巢癌、胰腺癌、直腸癌等惡性腫瘤組織細(xì)胞中[4]，當(dāng)Notch通路發(fā)生障礙，會發(fā)生遺傳性多發(fā)梗死綜合征、自身免疫性疾病、T細(xì)胞白血病等。有研究證實(shí)Notch通路在卵巢癌細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用[5]。

1 Notch信號通路及其經(jīng)典激活方式

哺乳動物有4個(gè)同源Notch受體Notch 1～4和5個(gè)配體Dll1、Dll3、Dll4、Serrate樣配體Jagged-1和Jagged-2。一般認(rèn)為，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是進(jìn)化上高度保守的一條通路，Notch受體通過與臨近細(xì)胞的結(jié)合發(fā)揮作用。Notch跨膜蛋白一般包括富含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)樣重復(fù)區(qū)域的胞外區(qū)、跨膜區(qū)、可作用于轉(zhuǎn)錄激活因子(CRT-binding factor 1，CBF-1)的胞內(nèi)區(qū)。經(jīng)典的Notch通路亦稱轉(zhuǎn)錄激活因子/Notch信號通路轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(recombination signal binding protein J kappa，RBP-Jk)依賴途徑。Notch先是以異二聚體的形式與臨近的配體Dll1、Dll3、Dll4及Jagged-1和Jagged-2相結(jié)合，隨后被金屬蛋白酶家族及解聚素剪切釋放于胞外，一旦被釋放，Notch蛋白的胞外區(qū)域被細(xì)胞以胞飲的形式內(nèi)吞，隨即以此為起點(diǎn)的下級偶聯(lián)發(fā)揮作用，在γ-分泌酶的剪切下，下游Notch胞內(nèi)活性成分(Notch intracellular domain，NICD)形成，并刺激下游CBF-1的高表達(dá)，繼而形成CBF-1/RBP-Jk抑制因子復(fù)合物，特異性與DNA序列“GGTGGGAA”相結(jié)合，通過招募輔抑因子維甲酸/甲狀腺受體沉默因子(silencing mediator of retinoid acid and thyroid hormone receptor，SMRT)、Ⅰ/Ⅱ型組蛋白去乙?；傅鹊鞍仔纬晒惨种茝?fù)合物，抑制下游基因轉(zhuǎn)錄，如影響細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、c-myc等的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化[6-7]，見圖1。

2 Notch信號通路在卵巢癌細(xì)胞中的異常表達(dá)

WANG等[1]研究發(fā)現(xiàn)，Notch1、Notch3受體及其配體Dll4與Jagged-1在卵巢癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織，且發(fā)現(xiàn)Dll4在卵巢癌組織中表達(dá)相比于交界性及正常組織具有高度差異和獨(dú)立性，且認(rèn)為其與微血管密度(microvessel density，MVB)相關(guān)。Jung等[2]研究發(fā)現(xiàn)，相比于卵巢良性增生性病變，Notch3受體在卵巢漿液腺及透明細(xì)胞癌中表達(dá)顯著升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而其配體Jagged-1及Jagged-2升高不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Rahman等[8]用免疫組化分析了111例卵巢癌組織中Notch3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)61例(55%)在胞核或胞漿中陽性表達(dá)，而正常卵巢組織中無Notch3的表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢細(xì)胞相比，卵巢癌細(xì)胞中Notch3基因的擴(kuò)增現(xiàn)象定位于染色體19p13.12，提示其與腫瘤發(fā)生可能相關(guān)，熒光定量PCR及熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)水平均證實(shí)Notch3基因DNA及mRNA轉(zhuǎn)錄水平的擴(kuò)增與Notch3在卵巢癌細(xì)胞19號染色體上的擴(kuò)增具有顯著相關(guān)性[3]。

注：鄰近細(xì)胞配體結(jié)合到相鄰細(xì)胞Notch跨膜蛋白的膜外區(qū)域，通過兩次蛋白水解形成Notch細(xì)胞內(nèi)活性區(qū)域(NICD)，NICD定位于細(xì)胞核后通過與CBF1結(jié)合來調(diào)節(jié)不同基因，包括HES-1、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κappa B，NF-κB)等。

圖1 Notch信號通路

Fig.1 Notch signaling pathway

3 Notch信號通路在卵巢癌細(xì)胞中的作用

3.1 Notch1受體及Notch2受體

3.1.1 Notch1受體單獨(dú)刺激下游轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而影響細(xì)胞增殖

在Notch1高表達(dá)的細(xì)胞中常發(fā)現(xiàn)HES-1(hairy enhancer of split 1)或其他下游因子的高表達(dá)，如前列腺惡性細(xì)胞疾病、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及卵巢癌細(xì)胞，但不能說明Notch1能直接刺激轉(zhuǎn)錄因子HES-1進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化。Notch2或者音猬因子(sonic hedgehog，SHH)也可通過HES-1發(fā)揮作用，當(dāng)Notch1活性區(qū)域NICDI穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞后，A2780細(xì)胞株的48小時(shí)細(xì)胞活力高于對照組127%、72小時(shí)的活力高于對照組72%[9]，提示Notch1可單獨(dú)刺激下游HES-1信號通路來刺激細(xì)胞活力[10]。Drenzek等[11]用黃腐酚抑制Notch1信號同路上CBF-1與下游轉(zhuǎn)錄基因的結(jié)合，熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證抑制效果后，蛋白質(zhì)印記法(western bolt，WB)結(jié)果提示p21WAF1/CIP1在黃腐酚干擾后的SKOV3及OVCAR3顯著升高，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性；進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)干擾后的SKOV3及OVCAR3細(xì)胞S期及G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，磷酸化周期素依賴激酶2(phospho-cdc2 Tyr15，CDC2)檢測確認(rèn)了黃腐酚干擾后卵巢癌細(xì)胞通過捕獲S期及G2/M期細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3.1.2 Notch1胞內(nèi)活性區(qū)域的促細(xì)胞增殖作用

Notch1胞外區(qū)在卵巢惡性腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中表達(dá)無明顯差異，而胞內(nèi)活性區(qū)NICD的表達(dá)具有明顯差異。Rose等[12]的研究表明，NICD在卵巢癌細(xì)胞OVCAR3、SKOV3、CAOV3中均相較于對照組高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)在乳頭狀腺癌的患者中，NICD表達(dá)的比例占76%；NICD的表達(dá)還與卵巢癌的臨床分期相關(guān)，NICD表達(dá)隨著卵巢癌臨床分期的嚴(yán)重而呈上升趨勢；當(dāng)干擾RNA沉默NICD后，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)證實(shí)NICD在促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖中發(fā)揮了重要作用。Groeneweg等[13]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著Notch家族配體(Delta、Serrate、Lag3、DSL-family)與Notch受體的結(jié)合，在腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor-a-converting enzyme，TACE)作用下，卵巢腺癌細(xì)胞胞內(nèi)NICD通過與Notch信號通路轉(zhuǎn)錄輔助激活蛋白(mastermind-like factors，MAML)及轉(zhuǎn)錄輔酶A(transcriptional coactivators，CoA)結(jié)合形成下游轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，進(jìn)而依靠HES與斷裂基因4轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白樣增強(qiáng)子(transducin-like enhancer of split，TSL)的協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞增殖。

3.1.3 Notch1受體具有部分抑癌基因作用

Notch1及Notch2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，免疫組化染色結(jié)果表明Notch1在細(xì)胞中的異位情況隨著細(xì)胞惡性程度的增高而呈下降趨勢，Notch1在漿液性囊腺瘤及黏液性囊腺瘤中陽性率分別為50%和33.3%，其中13%及33.3%為明顯胞內(nèi)異位(+++)，而交界性腫瘤的陽性率則為20%；Notch2在卵巢惡性腫瘤、交界性、良性組織中陽性率分別為97%、100%、83%[14]。由此可見，Notch1可能具有某些抑癌基因的作用，而Notch2在卵巢惡性細(xì)胞、交界性、良性細(xì)胞中均高表達(dá)，3種細(xì)胞之間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Notch2在卵巢癌細(xì)胞的增殖中可能存在作用而與卵巢癌的發(fā)生機(jī)制無明顯關(guān)系。

3.1.4 Notch1受體信號通路對卵巢癌細(xì)胞耐藥性及細(xì)胞凋亡的作用

WANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，用間接抑制Notch活性的γ-分泌酶抑制劑{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT}抑制Notch信號通路后，可通過調(diào)節(jié)下游細(xì)胞周期因子cyclin B1、Bcl-2及Caspase-3，捕捉處于G2期的卵巢癌細(xì)胞來降低細(xì)胞耐藥性，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。該研究還發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用DAPT及順鉑處理卵巢癌耐藥細(xì)胞可得到不同結(jié)果：DAPT處理后再予順鉑處理，卵巢癌耐藥細(xì)胞可使二者拮抗卵巢癌細(xì)胞的作用增強(qiáng)，而順序相反則無明顯抗卵巢癌耐藥細(xì)胞作用，與此同時(shí)，Groeneweg等[13]發(fā)現(xiàn)，用γ分泌酶抑制劑(gamma-secretase inhibitor，GSI)處理卵巢癌細(xì)胞后，可提高2/3卵巢癌細(xì)胞對鉑類藥物敏感性(P<0.05)，且GSI聯(lián)合紫杉醇可使卵巢癌細(xì)胞對化療藥物敏感性大于二者單獨(dú)使用，有趣的是，使用GSI后似乎并不影響傳統(tǒng)環(huán)磷酰胺聯(lián)合順鉑化療方案療效[13，15-16]。

3.2 Notch3受體

3.2.1 Notch3可以通過非核轉(zhuǎn)錄因子通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖

Jagged-1配體是卵巢癌細(xì)胞中最常見的配體，研究表明其通過調(diào)節(jié)血管形成調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展及微環(huán)境，對Jagged-1配體沉默后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的黏附和生長能力有顯著降低[16]。Park等[17]研究表明，Jagged-1的激活有賴于Notch3通路的激活，Notch3胞內(nèi)活性片段上調(diào)后可激活Jagged-1，而單向敲除Jagged-1后，對Notch3的影響不明顯，由此表明，Notch3不但通過經(jīng)典NF-κB通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，還可激活Jagged-1配體活化細(xì)胞。

3.2.2 Notch3及其下游胞內(nèi)活性區(qū)域?qū)β殉舶┘?xì)胞分化及轉(zhuǎn)移中的作用

Rahman等[8]發(fā)現(xiàn)Notch3陽性卵巢癌細(xì)胞用RNA干擾后，細(xì)胞增殖活力明顯低于Notch3陰性細(xì)胞，提示Notch3對于卵巢癌細(xì)胞具有增殖促進(jìn)作用。Jung等[2]研究結(jié)果提示，Notch3在卵巢癌細(xì)胞及卵巢正常細(xì)胞中陽性率分別為78%(45/58)、24%(5/21)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Notch3下游活性因子NICD在所有卵巢細(xì)胞中均有表達(dá)，卵巢惡性細(xì)胞與正常細(xì)胞表達(dá)水平分別為1.64±0.19(/103)、0.98±0.2(/103)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.216，P<0.05)；卵巢癌細(xì)胞中低分化與中高分化、Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌組織中NICD的表達(dá)具有明顯差異，而卵巢癌的病理類型、手術(shù)-病理分期以及是否行放化療與NICD的表達(dá)無關(guān)[2，6]，提示Notch3對卵巢癌細(xì)胞的增殖特別是分化及轉(zhuǎn)移具有明顯促進(jìn)作用。

3.3 Notch4受體

目前對Notch4受體通路在卵巢癌細(xì)胞中作用的研究較少，僅有研究表明其可能與卵巢癌細(xì)胞增殖[6]有關(guān)，并有可能作為卵巢癌干細(xì)胞潛在表面分子標(biāo)志[18]。

4 討論

Notch1及Notch2對卵巢癌細(xì)胞具有明顯促進(jìn)增殖作用，而Notch1具有某些抑癌基因作用，同時(shí)Notch1及Notch2對于卵巢癌細(xì)胞發(fā)生機(jī)制無明顯相關(guān)性；Notch3可通過非經(jīng)典NF-κB途徑調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖、分化，對卵巢癌細(xì)胞分化及臨床轉(zhuǎn)移具有明顯促進(jìn)作用。

順鉑和卡鉑類藥物通過損傷DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Notch信號通路抑制劑GSI抑制Notch下游因子后，組蛋白γ-H2AX中心點(diǎn)的氧化磷酸化反應(yīng)揭示抑制后DNA損傷作用[19]，猜想GSI可增加耐藥細(xì)胞株對于鉑類藥物的敏感性，其機(jī)制可能與增加DNA損傷作用、捕獲處于G2/M期卵巢癌細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，提示GSI可能作為克服鉑類化療藥耐藥問題的有效途徑。

有趣的是，在Notch受體信號通路激活方面，有研究者發(fā)現(xiàn)用GSI抑制Notch通路后，細(xì)胞增殖抑制作用無明顯變化[20]，可能存在兩種可能，①Notch下游通路激活非經(jīng)典Notch通路依賴性；②Notch受體可能存在持續(xù)性激活特點(diǎn)導(dǎo)致GSI作用后無明顯變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-128、miR-215/625或miR-502-5p等低表達(dá)與PPARG、RUNX1和CCND1基因高表達(dá)后，卵巢癌患者的生存率明顯下降，提示某些基因表型修飾后有可能通過miRNA結(jié)合mRNA3'端非翻譯區(qū)，進(jìn)而結(jié)合下游細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平啟動子區(qū)域激活Notch通路[21]，而當(dāng)用FSH刺激細(xì)胞后，Notch通路的激活提示Notch通路活化的多樣性[22]，這都提示Notch通路激活具體機(jī)制及調(diào)控細(xì)胞周期機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Notch signaling pathway and its role in ovarian cancer cells

XIONG Ai-wei, XIE Jing-yan

(DepartmentofGynaecology,NanjingFirstHospital,NanjingMedicalUniversity,JiangsuNanjing210006,China)

Notch is a evolutionarily conserved transmembrane receptor family, which accelerates the proliferation and differentiation of ovarian cancer cells by activating Notch intracellular domain (NICD) at lower part of Notch signaling pathway and thus affects drug resistance characteristics. Combined with different ligand binding, Notch plays different roles in different cellular environment, which indicates the variety of pathway activation. This review focused on the effect of Notch signaling pathway to activate NICD by combining different ligand binding.

Notch signaling pathway；ovarian cancer；proliferation；differentiation

2015-02-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81572557)

熊愛為(1989-)，男，在讀碩士研究生，主要從事婦科惡性腫瘤的研究。

謝靜燕，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.071

R737.31

A

1673-5293(2015)05-1100-03