任曉俠，方 瑩，楊洪彬

(西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003)

TNF-α在小兒結腸息肉中的表達及臨床意義

任曉俠，方 瑩，楊洪彬

(西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003)

目的 探討內源性腫瘤壞死因子α(TNF-α)在小兒結腸息肉中的表達及臨床意義。方法 采集45例結腸息肉患兒(實驗組)及36例正常結腸粘膜兒童(對照組)的血清，運用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測TNF-α在兩組血清中的表達；免疫組化法檢測TNF-α在兩組患兒結腸組織中的表達，分析TNF-α的表達與結腸息肉的關系。結果 TNF-α在實驗組血清中的表達高于對照組(t=5.360，P<0.05)，在實驗組結腸組織中表達高于對照組(χ2=10.434，P<0.05)；在實驗組中，腺瘤性息肉中TNF-α的表達較幼年性息肉中無明顯差異(P>0.05)。結論 TNF-α在結腸息肉組織中的高表達，提示TNF-α在兒童結腸息肉的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，有可能成為判斷結腸息肉預后復發(fā)的標志物。

腫瘤壞死因子α；兒童；結腸息肉；病理診斷；夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗法；免疫組化

結腸息肉是兒童消化系統(tǒng)常見疾病。大多數(shù)為單發(fā)、且為良性病變，病理分為幼年性、腺瘤性、炎癥性和增生性等四種，其中90%為幼年性息肉，常見于2～10歲的兒童，由炎癥引發(fā)的幾率較大。在患病兒童中，一般以6歲左右較為常見[1]。結腸息肉最常見的癥狀為間歇性無痛性便血，占80%～100%，隨著全結腸鏡檢查技術的普及應用，結腸息肉的檢出率逐漸升高。結腸息肉也是兒童最常見良性腫瘤之一[2]?；純喝舻貌坏接行е委?，免疫力會顯著降低，同時并發(fā)因慢性失血所致的缺鐵性貧血和營養(yǎng)不良等癥狀，長期以往會影響患兒生長發(fā)育，甚至可引起腸套疊等外科急腹癥。但結腸息肉的病因及發(fā)病機制至今仍不清楚[3]，其中結腸粘膜長期的炎癥刺激是公認的病因之一。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是機體內的一種生物活性因子，由肺泡巨噬細胞產(chǎn)生，活性強，在機體炎癥反應中發(fā)揮重要作用。本研究通過測定TNF-α在結腸息肉患兒血清及組織中的表達水平，探討其在小兒結腸息肉發(fā)病機制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集西安市兒童醫(yī)院2010年5月至2012年12月在消化科行結腸鏡檢查的221例有消化道癥狀的患兒。從中篩選出45例確診為結腸息肉的患兒納入研究(實驗組)，其中男28例，女17例，年齡3～12歲。男女比例1.64:1，平均年齡6.24±2.8歲，年齡10歲以上8例。其中因反復無痛性便血就診而行結腸鏡檢查確診息肉的有42例，便血病程1～12月，平均病程6.4±3.1個月，多表現(xiàn)為間斷出現(xiàn)的成形大便表面帶鮮血或者便后滴鮮血；另有3例以腸套疊收住普外科，入院后行空氣灌腸后腸套疊復位成功，出院后短時間再次腸套疊，再次空氣灌腸灌通后行結腸鏡檢查，鏡下診斷結腸息肉，3例患兒息肉位置均較深，于右半結腸處，長粗蒂，直徑均在2.5～3cm之間；45例患兒結腸息肉直徑大小在0.8cm～3.0cm之間。無蒂息肉16例，亞蒂息肉20例，粗蒂9例。單發(fā)結腸息肉37例，2個或2個以上結腸息肉8例。45例結腸息肉患兒均行電子結腸鏡下電凝切除術。術后隨訪僅1例復發(fā)者，為結腸多發(fā)息肉患兒。將結腸鏡檢查為正常結直腸粘膜的兒童36例納入對照組(排除合并炎癥性腸病等其他疾病，且資料不完整者)。兩組患兒性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性，兩組患者及家長知情，行結腸鏡檢查前均簽署了知情同意書。

1.2 診斷標準

采用Olympus Q260AI電子結腸鏡行全結腸檢查，發(fā)現(xiàn)息肉，根據(jù)其大小、數(shù)量及蒂的長短，靜脈復合麻醉下經(jīng)ERBE電刀高頻電凝電切摘除結腸息肉治療，根據(jù)其息肉的病理進行診斷。

1.3 納入與排除標準

入組患者符合小兒結腸息肉的診斷標準，年齡3～12歲之間，臨床資料完整，能夠較好的配合實驗。排除有腸道腫瘤、先天腸管畸形患者，排除心、腎功能不全患者，排除哭鬧較嚴重、不能配合實驗患者。

1.4 方法

1.4.1 血清及病理組織的采集

兩組患兒入院后，采集空腹清晨血，存血容器需保證無熱原且無內毒素，全程不干擾細胞活性。采血完畢后，以3 000r/min進行離心處理，持續(xù)10min，分離血清和紅細胞。

實驗組患者結腸息肉予以結腸鏡電凝切除處理，將結腸息肉標本于10%福爾馬林液中儲存并石蠟包埋。對照組患兒在進行結腸鏡檢查后，乙狀結腸至直腸位置取活檢于10%福爾馬林液中儲存并石蠟包埋，備用。

1.4.2 腫瘤壞死因子α的測定

1.4.2.1 運用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測腫瘤壞死因子α在血清中的表達 進行雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，在TNF-α抗體內，分別添加標本、標準品和辣根過氧化物酶(HRP)標記抗體，用于檢測，溫育處理后清洗干凈，并選取四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進行顯色，顯色過程中，由于有過氧化物酶的參與，由藍色轉換為黃色。實驗中顏色與TNF-α有直接關聯(lián)。波長控制在450nm內，選取酶標儀吸光度(OD值)進行檢測，得出樣品濃度。繪制Excel工作表，橫坐標為標準品濃度，縱坐標為其OD值，在曲線圖像中，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.4.2.2 免疫組織化學染色方法檢測組織中腫瘤壞死因子α的表達濃度 選擇美國ZYMED公司SP系列：抗人TNF-αbs-0078R為一抗，二抗為山羊抗兔IgG SP-0023，具體步驟：石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5min；3%H2O2去離子水孵育15min，以消除內源性過氧化物酶活性；滴加適當比例稀釋的一抗，370C孵育2～3h或40℃過夜，PBS沖洗，3min×3次，滴加二抗工作液，370C孵育10～15min；PBS沖洗，3min×3次；加入辣根酶對鏈酶卵白素工作液進行標記處理并賦予15min，保持環(huán)境溫度以37℃為宜；PBS沖洗，3min×3次；顯色劑顯色，自來水沖洗，復染、脫水、透明，最后進行封片。對照試驗：陰性對照選取PBS。

結果判斷：TNF-α陽性細胞：主要為胞漿著色，呈淺黃色、細顆粒狀，陰性對照均無陽性著色。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 病理類型分布

45例息肉患兒經(jīng)電子結腸鏡下行電凝切除術，切下息肉標本通過病理診斷發(fā)現(xiàn)，其中41例為幼年性息肉，4例為腺瘤性息肉。幼年性息肉病理特點：息肉為擴張的充滿黏液的彎曲的囊腺和在突起的固有層中的炎性細胞，腺體含有分化良好的黏液細胞，間質明顯增寬，內有豐富的結締組織，其中含大量的血管和炎性細胞。腺瘤性息肉病理特點：腫物由增生的腺體和纖維組織構成，局部腺體排列密集，見圖1。

a.正常結腸粘膜(10×20) b.腺瘤性息肉(10×20) c.幼年性息肉(10×20)

a. Normal colonic mucosa(10×20) b. Adenomatous polyp(10×20) c. Juvenile polyp(10×20)

圖1 兩組結腸粘膜的病理結果

Fig.1 Pathological results of colon mucosa of two groups

2.2 兩組患者血清中腫瘤壞死因子α水平的比較

ELISA法顯示：與正常粘膜組比較，實驗組患者血清中TNF-α水平較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3 腫瘤壞死因子α在兩組結腸組織中的表達

應用免疫組織化學分析TNF-α在對照組及實驗組中的表達，表達過程多由細胞漿參與。如圖2所示，對照組的樣本中，TNF-α染色的組織部分較少，且呈淺黃色，說明對照組TNF-α表達較低。而實驗樣本的結腸息肉組織中，可觀察到較多的淺黃色組織顆粒，說明TNF-α在實驗組織中表達較高，P<0.05，有統(tǒng)計學意義。其中在實驗組中腺瘤性息肉TNF-α的表達較幼年性息肉無明顯差異，P>0.05，見表2。

a.正常結腸粘膜(10×20) b.腺瘤性息肉(10×20) c.幼年性息肉(10×20)

a. Normal colonic mucosa(10×20) b. Adenomatous polyp(10×20) c. Juvenile polyp(10×20)

圖2 兩組結腸組織中TNF-α的表達

Fig.2 Expression of TNF-α in colonic tissue of two groups

表2 兩組患者TNF-α陽性率比較[n(%)]

Table 2 Comparison of TNF-α positive rate between two groups[n(%)]

2.4 在結腸組織中腫瘤壞死因子α的表達與臨床病理特征

在45例結腸息肉患兒的實驗組織中，TNF-α的表達陽性率與患兒性別、年齡、息肉部位、息肉大小、病理類型均無明顯關系(均P>0.05)，但其在多發(fā)實驗組中的表達陽性率高于單發(fā)實驗組中的陽性率，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。其中1例復發(fā)患兒為多發(fā)結腸息肉，其粘膜組織中TNF-α的表達為陽性，因復發(fā)組樣本數(shù)目較少，故無法進行統(tǒng)計學分析。

表3 結腸息肉組織中TNF-α的表達與臨床病理特征[n(%)]

Table 3 TNF-α expression and clinicopathological features in colonic polyps[n(%)]

3 討論

3.1 腫瘤壞死因子α在腫瘤組織及炎癥性疾病中的作用

TNF-α是一種由單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞產(chǎn)生的細胞因子，是重要的促炎因子和免疫調節(jié)因子，在腫瘤組織及炎癥性疾病均發(fā)揮重要作用。在腫瘤惡變過程中，機體的巨噬細胞、嗜中性粒細胞、T細胞等的浸潤情況較為明顯。在炎癥發(fā)生的最初，機體會產(chǎn)生TNF-α，與機體血管與組織的修復以及腫瘤的生長等方面均有密切聯(lián)系。研究證實，予以小鼠TNF-α拮抗劑，觀察其結腸腺瘤性息肉與結腸癌的轉換情況，發(fā)現(xiàn)轉化的數(shù)量明顯減少[4]。TNF-α可以激活機體的激活劑蛋白-1(AP-1)和轉錄因子NF-KB途徑，并以該兩種方式使細胞加速繁殖，使腫瘤病情加快發(fā)展。實驗證實，肝癌動物模型在MdrZ缺失的情況下，TNF-α可以通過激活NF-KB的方式影響病情[5]，腸道腫瘤方面，作用方式尚不清楚。在對結腸癌的動物進行探究時發(fā)現(xiàn)，與上皮細胞相比，TNF-α受體在造血細胞的表達更強[6]。兒童結腸息肉大部分為良性病變，但仍存在惡變潛能。多發(fā)性息肉如幼年性息肉病則有癌變傾向，腺瘤性息肉與癌關系密切，其癌變發(fā)生率隨著瘤體的增大而增高；病理發(fā)現(xiàn)，有些患兒癥狀表現(xiàn)為幼年性息肉與腺瘤性息肉共同特征，惡化幾率明顯增加[7]。其他如家族性息肉病(familial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP)及Peutz-Jeghers綜合征(PJS)也屬癌前病變。本研究中免疫組織化學分析TNF-α在正常粘膜組結腸粘膜及實驗組結腸息肉中的表達，TNF-α在以上組織中以細胞漿表達為主。在正常粘膜組織中，TNF-α染色后黃色顆粒組織面積較小，證明TNF-α在正常組粘膜組織中的表達較弱，而在結腸息肉組織，可觀察到大量的淺黃色顆粒，證明實驗組織中TNF-α表達較強，尤其在靠近血管的組織附近，表達明顯增強。

3.2 腫瘤壞死因子α兒童結腸息肉組織中的表達

目前，兒童結腸息肉的病理類型大多為幼年性息肉，但其病因尚不清楚，其中，炎性起源學說認為是由于腸粘膜對局部刺激的應答而產(chǎn)生，認為幼年性息肉的形成可能與糞石對黏膜的慢性損傷有關，唾黏蛋白和硫酸黏蛋白在幼年性息肉與炎性息肉中有相同分布；同時在幼年性息肉中觀察到上皮細胞的再生改變以及突出的間質反應，包括水腫、炎性細胞浸潤、輕度纖維化和腺體囊性改變[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫組化顯示在實驗組中的TNF-α表達明顯高于正常粘膜組，而在實驗組中腺瘤性息肉TNF-α的表達較幼年性息肉無明顯差異，提示TNF-α作為一種炎癥因子可能在息肉或腺瘤的發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用；另外，本研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)實驗組中的表達陽性率高于單發(fā)實驗組中的陽性率，但差異無統(tǒng)計學意義，不除外與多發(fā)實驗組樣本量太小有關；在隨訪觀察中，其中1例復發(fā)患兒為多發(fā)結腸息肉，其粘膜組織中TNF-α的表達為陽性，提示TNF-α可能在息肉的復發(fā)中亦發(fā)揮作用，但因復發(fā)樣本小，無法行統(tǒng)計學分析，仍需長期隨訪證實。

綜上所述，TNF-α作為炎癥的一個重要細胞因子，它是炎癥反應的發(fā)起者。TNF-α在兒童息肉的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定的作用，為今后研究小兒結腸息肉發(fā)病機制提供一定的參考意義。在結腸息肉患兒中，有3%的惡化幾率，因此，在醫(yī)院接診患兒時，應予以全方面的腸道檢查，一旦觀察到有息肉的出現(xiàn)，應立即予以切除，從而控制患兒病情。針對年齡大于10歲的患兒，應做到完全切除，不留惡化的隱患，并在治療后進行定期病情隨訪。對于兒童長期的腹瀉及便秘，應及時糾正，預防息肉的發(fā)生。

[1]Hood B, Bigler S, Bishop P,etal.Juvenile Polyps and Juvenile Polyp Syndromes in Children: a Clinical and Endoscopic Survey[J]. Hood B1, Bigler S, Bishop P,2011,50(10):910-915.

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[4]張姝翌,王邦茂,譚華,等.環(huán)氧合酶在結腸腺瘤性息肉及結腸癌組織中的表達[J].天津醫(yī)科大學學報,2007,13(2):162-164.

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[6]李博.表皮生長因子受體(EGFR)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)聯(lián)合作用對結腸癌細胞生長抑制的研究[D].吉林：吉林大學,2011.

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[8]張莉娜.兒童結直腸幼年性息肉及其研究進展[J].國際兒科學雜志,2012,39(6):566-568.

[專業(yè)責任編輯：王寶西]

Expression and clinical significance of TNF-α in children with colon polyps

REN Xiao-xia, FANG Ying, YANG Hong-bin

(Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of endogenous tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in children with colonic polyps. Methods Serum of 45 cases (experimental group) with colonic polyps and 36 cases (control group) with normal colonic mucosa was detected with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to explore the expression of TNF-α. Immunohistochemical method was used to detect the expression of TNF-α in colonic tissue. The relationship between expression of TNF-α and colonic polyps was analyzed. Results The expression of TNF-α in serum was higher in the experimental group than in the control group (t=5.360,P<0.05), so was in colonic tissue (χ2=10.434,P<0.05). In the experimental group the expression of TNF-α was not significantly different between adenomatous polyp and juvenile polyp (P>0.05). Conclusion High expression of TNF-α in colon polyps suggests that TNF-α may play an important role in the development and progression of colon polyps in children. It may be a marker for judging the prognosis of colon polyps.

tumor necrosis factor alpha (TNF-α); children; colon polyps; pathological diagnosis; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); immunohistochemistry

2015-07-14

任曉俠(1977-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒童消化道疾病的內鏡下診斷及治療。

方 瑩，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.022

R725.7

A

1673-5293(2015)05-0973-04