齊飛 張曉宇 李若溪

人角膜基質(zhì)常溫下氮?dú)饷摷?xì)胞法的初步研究

齊飛 張曉宇 李若溪

目的研究室溫下對(duì)取自于角膜激光屈光手術(shù)削除的基質(zhì)瓣進(jìn)行無(wú)毒化脫細(xì)胞處理的方法。方法在無(wú)菌條件下收集激光屈光手術(shù)后廢棄的人角膜基質(zhì)瓣。角膜瓣沖洗2～3次后置于5 ml離心管中。將離心管充滿氮?dú)獠⒎夤?常溫或4℃冰箱保存7 d。取出角膜瓣,再次沖洗2～3次后恒溫震蕩24 h,每隔1～2 h換液,得到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)瓣。對(duì)上述處理后的角膜基質(zhì)瓣進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)及Hoechst 33342染色以觀察脫細(xì)胞效果。結(jié)果經(jīng)上述處理獲得的角膜基質(zhì)瓣透明度良好,HE染色及Hoechst 33342染色未見(jiàn)明顯基質(zhì)細(xì)胞殘留。結(jié)論本研究取材于角膜激光屈光手術(shù)削除的基質(zhì)瓣,經(jīng)過(guò)無(wú)毒化脫細(xì)胞處理,解決了角膜基質(zhì)來(lái)源和脫細(xì)胞試劑毒性殘留的問(wèn)題,有較好的臨床應(yīng)用前景。

角膜；角膜基質(zhì)；氮?dú)?；脫?xì)胞

中國(guó)公民因單眼和雙眼角膜病致盲的盲人約300～500萬(wàn),僅次于白內(nèi)障,居眼科致盲疾病的第二位。導(dǎo)致角膜盲的主要疾病包括各種感染性角膜病、角膜變性、嚴(yán)重機(jī)械外傷、眼表化學(xué)傷、重癥干眼癥等,幾乎涵蓋了所有角膜病種。其中大部分患者獲得有用視力的唯一方法是手術(shù)治療,而手術(shù)的主要方式是角膜全層或板層移植。我國(guó)由于受到傳統(tǒng)觀念和眼庫(kù)條件的限制,角膜捐獻(xiàn)者數(shù)量有限,治療成本昂貴,并且部分角膜供體由于時(shí)間和空間的限制不能得到及時(shí)充分的利用,因此遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求,給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大壓力。在角膜供體極為匱乏的情況下,利用細(xì)胞學(xué)和組織工程學(xué)手段獲得具有正常生理結(jié)構(gòu)和功能的角膜組織是使這些患者脫盲的關(guān)鍵技術(shù)。本研究針對(duì)眼科臨床工作的這一重大現(xiàn)實(shí)問(wèn)題,對(duì)角膜基質(zhì)組織的去細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行了研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究中使用人角膜基質(zhì)組織,來(lái)源于人眼經(jīng)

過(guò)激光屈光手術(shù)切削除去的角膜基質(zhì)瓣。

1.2 方法

1.2.1 角膜基質(zhì)瓣預(yù)處理 用消毒的顯微無(wú)齒鑷將激光屈光手術(shù)中切削去的表面光滑、厚度40～140 μm、平均直徑(8±2)mm的角膜基質(zhì)瓣,自手術(shù)臺(tái)上放入盛有含0.3wt％青鏈霉素的平衡鹽溶液(以下稱“洗滌液”)的1 ml規(guī)格的無(wú)菌eppendorf管中,轉(zhuǎn)移至二級(jí)B2型生物安全柜,在培養(yǎng)皿中注入洗滌液,取出角膜基質(zhì)瓣,并在培養(yǎng)皿中清洗2～3次,2～5 min/次。

1.2.2 去細(xì)胞過(guò)程 將角膜基質(zhì)瓣放入5 ml離心管中,使用便攜式氮?dú)馄繉㈦x心管中充滿氮?dú)?旋緊離心管管蓋并用封管膜封管,常溫或4℃保存5～7 d；之后在無(wú)菌條件下,取出角膜基質(zhì)瓣,轉(zhuǎn)移至二級(jí)B2型生物安全柜中,在培養(yǎng)皿中用洗滌液清洗2～3次,2～5 min/次,再在洗滌液中,在轉(zhuǎn)速150～250 rpm條件下,15～25℃恒溫震蕩處理24～36 h(恒溫震蕩培養(yǎng)箱,Labnet公司,型號(hào)211DS),并且每隔1～2 h換洗滌液1次,即得到脫基質(zhì)細(xì)胞的角膜基質(zhì)。

1.3 病理學(xué)研究 對(duì)脫細(xì)胞的角膜基質(zhì)瓣進(jìn)行HE及Hoechst 33342染色,觀察基質(zhì)瓣微結(jié)構(gòu)及有否細(xì)胞成分殘留。

2 結(jié)果

通過(guò)本方法獲得的角膜基質(zhì)瓣透明度好,無(wú)明顯細(xì)胞成分殘留,基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)接近正常角膜,未見(jiàn)明顯纖維碎裂、溶解。

3 討論

角膜表層組織包括角膜上皮層和部分基質(zhì)層,其結(jié)構(gòu)對(duì)維持眼表的生理功能和眼球的視覺(jué)功能具有十分重要的意義。角膜上皮目前已有多種重建方法并已應(yīng)用于臨床,取得了客觀的治療效果。而角膜基質(zhì)層的材料來(lái)源和脫細(xì)胞處理方式雖有多種,但存在以下問(wèn)題：①角膜基質(zhì)材料來(lái)自于人眼或動(dòng)物眼,人角膜組織相容性最好,但全層角膜來(lái)源匱乏,而來(lái)源于動(dòng)物眼的角膜基質(zhì)難以避免免疫反應(yīng)等問(wèn)題；②為盡量降低發(fā)生免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),用于角膜移植的角膜基質(zhì)需提前對(duì)角膜基質(zhì)上的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行脫細(xì)胞處理。脫細(xì)胞處理方式由起初的傳統(tǒng)凍融法發(fā)展至當(dāng)今普遍應(yīng)用的表面活性劑(即去污劑)洗脫法、液氮凍融法以及高靜水壓力法等,但均存在一些難以規(guī)避的問(wèn)題：例如反復(fù)凍融［1］和高靜水壓力［2］處理均可能導(dǎo)致膠原斷裂,損傷角膜基質(zhì)的張力；而表面活性劑均具有較大的毒性,處理后難以應(yīng)用于臨床,目前多停留于實(shí)驗(yàn)室階段。因此,尋找人角膜基質(zhì)供體的可靠來(lái)源以及安全有效的脫細(xì)胞方法是具有重大臨床實(shí)際意義的問(wèn)題。

關(guān)于人角膜基質(zhì)供體,激光屈光手術(shù)可能是非常理想的來(lái)源。現(xiàn)代激光屈光手術(shù)過(guò)程中取下的角膜基質(zhì)透鏡,厚度在40～140 μm左右,直徑約8 mm,光學(xué)特性、大小和操作性均符合角膜板層移植手術(shù)的要求,以往手術(shù)后即被作為醫(yī)療垃圾處理。據(jù)粗略統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年激光屈光手術(shù)量＞50萬(wàn)例,且呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì),若充分利用角膜基質(zhì)透鏡治療角膜盲患者,無(wú)疑是一盞為他們指路的明燈。

對(duì)角膜基質(zhì)脫細(xì)胞方法的研究已有數(shù)十年,如前所述,既往多種脫細(xì)胞方法都因其局限性而難以在臨床推廣。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外角膜病領(lǐng)域的學(xué)者逐漸重視到這些局限性,開(kāi)始探索如液氮凍融法等對(duì)角膜基質(zhì)膠原損傷較小、毒性較低的方法。而本研究與現(xiàn)有技術(shù)相比,其優(yōu)勢(shì)在于：①全部流程中應(yīng)用的藥劑均無(wú)明顯的毒性,可以最大程度保護(hù)角膜基質(zhì)的生物學(xué)特性并有效地去除基質(zhì)細(xì)胞。②易于操作,避免了反復(fù)凍融造成膠原斷裂而損傷組織張力。③本方法中脫去細(xì)胞碎片時(shí)是在無(wú)菌平衡鹽溶液進(jìn)行恒溫震蕩的方式,能較好地保持人角膜基質(zhì)內(nèi)的電解質(zhì)水平。

綜上所述,人角膜常溫氮?dú)饷摷?xì)胞法具有脫細(xì)胞完全、對(duì)角膜基質(zhì)膠原無(wú)損傷、全部流程中應(yīng)用的藥劑均無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn),可最大程度保護(hù)角膜基質(zhì)的生物學(xué)特性并有效地去除基質(zhì)細(xì)胞。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.24.054

2015-07-21］

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：F12-193-9-23),沈陽(yáng)市科技計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：F13-317-6-09)

110847 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)(李若溪)；沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院(齊飛 張曉宇 李若溪)

李若溪