陳 烜,侯玉立,李偉榮,張 棟,何芙蓉

血漿miRNAs在急性病理期缺血性腦卒中的表達(dá)譜分析

陳 烜1,侯玉立2,李偉榮3,張 棟4,何芙蓉3

目的探討缺血性卒中在病理分期的急性期(24 h內(nèi))外周血漿中miRNA的表達(dá)及臨床意義。方法選取急性腦梗死患者和健康對(duì)照者各5例。收集急性腦梗死患者發(fā)病24 h之內(nèi)的血漿和健康對(duì)照者的清晨空腹血漿。采用TaqManmicroRNA Arrays進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜篩選。使用相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件及統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果與健康對(duì)照組相比,在缺血性腦卒中發(fā)病24 h內(nèi)外周血漿中存在差異表達(dá)的miRNA。本研究共檢測(cè)有統(tǒng)計(jì)意義的顯著差異表達(dá)的miRNA 66個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的39個(gè),下調(diào)的27個(gè)。上下調(diào)倍數(shù)變化最顯著的miR 4498上調(diào)7.84倍(foldchange=7.84),miR 676-5P下調(diào)為0.167(fold change= 0.167),P均<0.05。結(jié)論急性缺血性腦卒中發(fā)病24 h內(nèi)外周血漿中即存在差異表達(dá)的miRNA,這些差異表達(dá)miRNA可能與缺血性卒中早期的缺血缺氧應(yīng)激,血腦屏障破壞,早期再灌注損傷等有關(guān),也有可能作為缺血性卒中早期干預(yù)新的治療方向和靶點(diǎn)。

缺血性卒中;急性病理期;血漿miRNA

缺血性腦卒中是危及我國人民健康的高發(fā)疾病,目前已有治療方法對(duì)缺血性卒中發(fā)病急性期積極干預(yù),但缺血性卒中的致殘率仍很高。微小RNA(m-i croRNA,miRNA)是目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)[1],可以通過與靶mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式在轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)控靶mRNA表達(dá),參與了許多疾病的病理生理過程,外周血漿中存在可以反映疾病變化的miRNA[2]。本研究使用基因芯片技術(shù),研究miRNA在急性缺血性卒中24 h內(nèi)與健康對(duì)照比較外周血漿中miRNA的變化,旨在建立缺血性卒中發(fā)病急性期內(nèi)的外周血漿表達(dá)譜,初步篩查在急性缺血性卒中早期起調(diào)控作用的miRNA,為急性缺血性卒中的早期治療干預(yù)提供新的思路和潛在的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 急性腦梗死患者5例,為太原市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收住的急性缺血性卒中患者。所有患者符合1995年第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn),均經(jīng)詳細(xì)的神經(jīng)系統(tǒng)檢查及頭顱MRI影像學(xué)檢查確診。排除自身免疫性疾病,惡性腫瘤、高熱、呼吸系統(tǒng)疾病等。對(duì)照組為5名健康志愿者,年齡、性別比例與患者相匹配。本研究所有標(biāo)本的獲取均經(jīng)研究對(duì)象同意。

1.2 試劑與儀器 總RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen)和miRNeasy mini kit試劑盒提取(Qiagen公司);使用microRNA miRCURYTmLNAArray(version 18.0)基因芯片篩選差異表達(dá)miRNA(丹麥Exiqon公司)

1.3 標(biāo)本收集 5例急性缺血性卒中患者收集急性發(fā)病24 h外周靜脈血。同時(shí)收集5名健康志愿者血漿。所有樣本于清晨空腹采集。使用EDTA抗凝管收集外周靜脈血6 mL,并輕輕上下顛倒混勻至于4℃冰箱保存,在1 h之內(nèi)進(jìn)行血漿分離。4℃2 000×g離心10min,取上層血漿移至1.5mL無RNA酶(RNasefree)離心管中。4℃1 600×g離心5 min,吸取上層漿至2 mL旋蓋尖底無RNA酶(RNase-free)離心管中;裝好置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血漿總RNA的提取和質(zhì)控 采用TRIzo l(Invitrogen)和miRNeasy minikit試劑盒(Qiagen公司)提取RNA。提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),使用紫外吸收測(cè)定法Nanod rop TM分光記錄儀會(huì)自動(dòng)完成所檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量,記錄OD260/OD280二者比值。

1.5 miRNA芯片標(biāo)記、雜交 使用microRNA miRCURYTmLNAArray(version 18.0)基因芯片篩選差異表達(dá)miRNA(丹麥Exiqon公司)。其LNA(locked Nuc leic Acid)鎖核酸,為一種特殊雙環(huán)狀核苷酸衍生物,對(duì)RNA有很好地識(shí)別能力和強(qiáng)大的親和力,可自由設(shè)定Tm值,使所有探針Tm值均一化,保證對(duì)所有的靶點(diǎn)具有相同的親和活性。能檢測(cè)到常規(guī)DNA探針無法檢測(cè)到的極其微量的miRNA。每張芯片對(duì)同一樣品重復(fù)4次,確保芯片的可靠性。采用miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling kit(Exiqon,Vedbaek,Denmark)標(biāo)記試劑盒,按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。采用miRCURYTmLNA Array雜交試劑盒(v.18.0)(Exiqon)按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程,對(duì)RNA進(jìn)行雜交。

1.6 掃描機(jī)數(shù)據(jù)處理 使用Axon GenePix 4000B microarray scanner對(duì)芯片圖形進(jìn)行掃描。使用Genep ix V6.0讀取原始圖像強(qiáng)度值。芯片中每4個(gè)重復(fù)探針的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。使用中位數(shù)將所有數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。將miRNA中所有掃描信號(hào)強(qiáng)度大于30的樣品去背景化矯正后,取這些數(shù)據(jù)的50%計(jì)算出median值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)miRNA進(jìn)行無人監(jiān)督聚類分析,篩選出差異表達(dá)的miRNA。fold changce>1.5或者<0.6(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 血漿總RNA的質(zhì)量 本實(shí)驗(yàn)獲得的總DNA樣本,經(jīng)紫外吸收測(cè)定法Nanod rop TM分光記錄儀檢測(cè),所有RNA樣本的OD260/OD280>1.6,為質(zhì)量合格的標(biāo)本。

2.2 急性缺血性卒中發(fā)病24 h差異表達(dá)miRNA的芯片結(jié)果 與健康對(duì)照組相比,急性缺血性腦卒中患者在發(fā)病的急性24 h內(nèi),共檢測(cè)到581個(gè)差異表達(dá)的miRNA。在581個(gè)差異表達(dá)miRNA中,425個(gè)為差異表達(dá)上調(diào)fo ldchange>1.5,156個(gè)為差異表達(dá)下調(diào)fo ldchange<0.6。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有66個(gè)miRNAs的差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。66個(gè)存在顯著差異表達(dá)miRNA,39個(gè)為差異表達(dá)上調(diào),27個(gè)為差異表達(dá)下調(diào);差異最顯著的有miR4498上調(diào)7.84倍(fo ldchange= 7.8 4),miR 1 8 1 d-3 p上調(diào)4.2倍(fo ldchange= 4.72),miR 5196上調(diào)4.04倍(fo ldchange=4.04), miR 676-5p下調(diào)為0.167(fold change=0.167)。缺血性卒中發(fā)病24 h與正常對(duì)照組血漿中存在差異表達(dá)的miRNA。

3 討 論

急性腦梗死的病理生理過程復(fù)雜,按照病理分期的界定,急性腦梗死在發(fā)病1 h~6 h為超早期,6 h～24 h急性期,24 h~48 h為壞死期,其后為軟化期和恢復(fù)期[3]。而在不同的病理時(shí)期,腦梗死組織的分子細(xì)胞生物水平的變化不同[4],有學(xué)者認(rèn)為缺血性卒中應(yīng)該按其病理生理分期分型治療。目前,公認(rèn)對(duì)缺血性卒中治療有效的超早期溶栓治療[5],但因地域交通、文化程度、對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)度等局限,能夠及時(shí)接受溶栓治療的患者只有一部分,而且接受了溶栓治療的患者中,也有一部分效果未盡如人意。因此更深的從細(xì)胞分子層面探索缺血性卒中發(fā)生的機(jī)制,為缺血性卒中早期的治療尋找新理論基礎(chǔ)和治療方向,有實(shí)際臨床意義。

微小RNA其強(qiáng)大的調(diào)控作用不僅參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生[5]、發(fā)育、成熟,也參與調(diào)控了神經(jīng)系統(tǒng)的疾病病理過程[6]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),缺血損傷后腦組織和血漿中的一些miRNA表達(dá)發(fā)生顯著改變[6,7]。Dha rap[8,9],從缺血再灌注3 h開始持續(xù)到第3天, miRNA的表達(dá)一直處于動(dòng)態(tài)變化中。Yuan[10]發(fā)現(xiàn),全腦缺血模型大鼠,在缺血20 min,再灌注30 min和24 h時(shí)血漿和腦組織中miRNA表達(dá)水平均出現(xiàn)改變。不同的miRNA在缺血性卒中中發(fā)揮不同的調(diào)控作用,如mir126、130a、210、21等可調(diào)控促進(jìn)血管形成[11]。miR124可以下調(diào)SCP1的表達(dá),從而誘導(dǎo)胚胎神經(jīng)發(fā)生,調(diào)控軸突生長過程[12]。小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究顯示miR124與卒中后腦組織損害有特異相關(guān)性,miR124在卒中8 h后血漿中濃度升高,在24 h急劇達(dá)到高峰[13]。這些研究說明了miRNA參與了急性腦梗死早期的疾病過程,并且調(diào)控了血管再生,神經(jīng)修復(fù)等病理過程[14]。局限性腦缺血后因動(dòng)脈血流灌注減少或血流完全中斷,腦組織缺血缺氧應(yīng)激,腦組織破壞崩解,出現(xiàn)一系列缺血造成的病理生理變化,稱缺血瀑布。缺血瀑布是一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮,破壞血腦屏障,增加腦水腫和細(xì)胞毒性酶釋放等[15]。

本研究針對(duì)急性缺血性腦卒中發(fā)病的24 h內(nèi)的血漿miRNA進(jìn)行表達(dá)譜分析。在急性缺血性卒中的24 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)581個(gè)有差異表達(dá)的miRNA,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,有66個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些在24 h出現(xiàn)顯著差異變化的miRNA,推斷與缺血性卒中啟動(dòng)、應(yīng)激等病理生理機(jī)制有關(guān)。針對(duì)這些在缺血性卒中急性24 h內(nèi)的miRNA的研究,可以使我們更深的了解“缺血瀑布”這一系列級(jí)聯(lián)分子事件最開始狀態(tài)的病理生理機(jī)制,并根據(jù)其作用的機(jī)制做出相應(yīng)的干預(yù),可以影響缺血性卒中的早期病理過程,或許可以成為缺血性卒中超早期干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異表達(dá)的miRNAs中,表達(dá)差異最顯著的有miRNA4498、miR181d-3p、miR5196、miR676-5p等,已有相關(guān)研究認(rèn)為抑制miR181可以減少缺血性腦卒中誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。

本研究豐富了血漿缺血性腦卒中miRNA差異表達(dá)譜。針對(duì)急性缺血性卒中24 h患者外周血漿中miRNA進(jìn)行分析,驗(yàn)證了缺血性卒中的急性期的一系列病理變化受特定的miRNA調(diào)控,為尋找缺血性卒中急性期起主要作用的機(jī)制和相關(guān)miRNA提供了一定的理論基礎(chǔ)。目前已在動(dòng)物研究使用miRNA抑制劑調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA,影響其下游蛋白的表達(dá),對(duì)疾病病理狀態(tài)產(chǎn)生治療作用。本實(shí)驗(yàn)中篩選出來的在24 h出現(xiàn)顯著差異的miRNA4498、miR181d 3p、miR5196、miR676-5p有望成為今后對(duì)缺血性卒中急性期干預(yù)的新的潛在治療靶點(diǎn)。但對(duì)這些miRNA的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制還未明確,還需要進(jìn)行大樣本驗(yàn)證和進(jìn)一步的靶基因研究。

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R743 R255

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10.3969/j.issn.1672-1349.2015.07.026

1672-1349(2015)07-0932-03

2015-03-11)

(本文編輯王雅潔)

山西省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃—社會(huì)出版項(xiàng)目(No.2013 313020-9)

1.山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院碩士研究生(太原030009);2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院;3.山西省太原市中心醫(yī)院;4.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

侯玉立,E-mail:ccccxuanxuan@163.com