王永貴　劉江濤　徐俊昌　莊正陵　劉濤　劉暢

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽醫(yī)院骨科，湖北襄陽　441021;

2.復旦大學附屬金山醫(yī)院外科教研室，上?！?00000)

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·論著·

低氧環(huán)境及不同流體靜壓下體外培養(yǎng)的人髓核細胞凋亡的變化

王永貴1劉江濤1徐俊昌1莊正陵1劉濤1劉暢2

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽醫(yī)院骨科，湖北襄陽441021;

2.復旦大學附屬金山醫(yī)院外科教研室，上海200000)

摘要目的：觀察體外培養(yǎng)的髓核細胞在低氧及不同流體靜壓下凋亡的變化。方法： 體外培養(yǎng)人退變髓核細胞，根據(jù)低氧環(huán)境隨機分成2組：低氧組和正常氧分壓組；然后根據(jù)不同流體靜壓條件再隨機分為3組：不加壓對照組、加壓50 kPa組和加壓100 kPa組；用MTT和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP 缺口末端標記(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)測定法檢測髓核細胞凋亡的變化。結(jié)果：低氧狀態(tài)下髓核細胞的存活率較正常氧分壓狀態(tài)高，凋亡細胞減少。在不同流體壓力下，50 kPa 壓力組髓核細胞的凋亡陽性率與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；100 kPa壓力組比對照組髓核細胞凋亡增加31.65%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論：低氧和低壓力環(huán)境可以減少髓核細胞的凋亡。

關(guān)鍵詞椎間盤退變；細胞凋亡；細胞低氧；流體靜壓

椎間盤退變發(fā)病率很高，是引起腰腿痛的主要原因之一。目前，椎間盤退變一般采用保守治療，但難于根治；椎間盤退變也可采用去除突出髓核、椎管擴大減壓及融合治療，但這種手術(shù)治療僅緩解臨床癥狀，無法恢復或重建椎間盤解剖結(jié)構(gòu)和生理功能，甚至可誘發(fā)鄰近節(jié)段退變。近年來，有學者從組織工程學角度對椎間盤退變進行了相關(guān)研究，但到目前為止，對于椎間盤退變的作用機制仍未闡明。有研究[1]認為，髓核細胞凋亡參與了椎間盤退變過程，并在此過程中起關(guān)鍵作用。因此，在椎間盤退變的病因?qū)W研究中，髓核細胞凋亡的作用機制越來越引起人們的重視，抑制髓核細胞凋亡可能成為治療椎間盤退變性疾病的一個重要手段。本研究采用體外培養(yǎng)人退變髓核細胞的方法，研究在低氧及不同流體靜壓下髓核細胞凋亡的變化，以期明確髓核細胞凋亡在椎間盤退變中的作用機制，認識退變髓核細胞的細胞學退變時機，并了解影響髓核細胞凋亡的相關(guān)因素，為今后抑制髓核細胞凋亡治療退變性椎間盤疾病的研究提供理論基礎(chǔ)。

1資料及方法

1.1一般資料選擇在湖北省襄陽市第一人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽醫(yī)院)骨科接受手術(shù)治療的40例腰椎間盤突出癥患者，其中男性24例，女性16例，平均年齡(39.0±16.6)歲。根據(jù)Gries評分標準，所有患者均為重度椎間盤退變。納入標準：以下肢疼痛為主要癥狀的L4~L5或者L5~S1腰椎間盤突出癥患者。排除標準：合并腰椎不穩(wěn)定或腰椎管狹窄癥患者。進入臨床研究的患者均簽署知情同意書，并由醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2實驗材料Pfu高保真Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pGEM-T載體和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；瓊脂糖粉購自美國BD公司；去磷酸化酶試劑盒購自日本Takara公司；10%(體積分數(shù))小牛血清、DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；可控壓力細胞加載裝置購自上海金達生化儀器公司。

1.3實驗方法本實驗在湖北醫(yī)藥學院第四附屬醫(yī)院實驗室完成。

1.3.1髓核細胞的分離和培養(yǎng)手術(shù)從后側(cè)入路，取出椎間盤組織。用含青-鏈霉素雙抗的0.9%氯化鈉溶液浸泡椎間盤10 min，用刮匙輕輕將髓核組織從椎間盤中分離。分離纖維環(huán)組織與髓核組織時，依靠肉眼和手感等進行區(qū)分。髓核組織呈半透明膠凍狀，用眼科剪容易剪碎，無韌性；而纖維環(huán)呈白色柔韌狀，用眼科剪剪切時充滿阻力，韌性較高。用含雙抗的0.9%氯化鈉溶液將髓核組織浸泡沖洗，直至無明顯血跡，然后用眼科剪將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，放入盛有10 mL 2%Ⅱ型膠原酶的100 mL燒杯中，用磁力攪拌器攪拌約60 min。待組織完全溶解后，1000 r/min離心10 min，吸出上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1 mL輕輕吹散細胞，然后將細胞吸至50 mL容量的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液6～8 mL，靜置于37 ℃、飽和濕度且CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況，隔天換液，當細胞融合率接近90%時進行傳代[2]。

1.3.2髓核細胞的洗滌及傳代棄去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS洗滌細胞2次，棄去洗滌液。沿瓶壁加入數(shù)滴含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的混合消化液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，光學顯微鏡下觀察細胞消化情況。待細胞出現(xiàn)皺縮、間隙加大，個別細胞變圓漂浮時，立即用含血清的培養(yǎng)液3 mL終止消化，并用滴管輕輕吹打細胞數(shù)次，制成細胞懸液。將細胞懸液以1000 r/min離心5 min，棄上清液，用培養(yǎng)液混懸細胞(體積比為1∶2)后重新接種及培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同原代培養(yǎng)。取生長良好的第2代髓核細胞，參照說明書以TRIzol試劑提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板，擴增Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。PCR反應(yīng)引物：蛋白聚糖的上游引物5’-GGGTGAGGTCTTTTATGCCA-3’，下游引物5’-GCTTTGCAGTGAGGATCACA-3’；Ⅱ型膠原的上游引物5’-CAAGTCGCTGAACAACCAGA-3’，下游引物5’-GCCCTCATCTCCACATCATT-3’；Ⅰ型膠原蛋白的上游引物5’-CAACAAATCCCCACACAC-3’，下游引物5’-CACACAAAGACAAGAACGAG-3’；內(nèi)參GAPDH的上游引物5’-AGAACATCATCCCTGCATCC-3’，下游引物5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 min(Bax和Bcl-2基因分別為54℃和59℃退火30 s)，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察拍照[3]。

1.3.3凋亡髓核細胞的形態(tài)觀察將手術(shù)后分離的髓核組織用40 g/L戊二醛固定1 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗5 min，沖洗3次；再用10 g/L四氧化鋨固定1.5 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)沖洗5 min，沖洗3次；然后用梯度乙醇溶液脫水，丙酮與等劑量的Epon812混合液浸透3 h，最后用Epon812包埋并60℃聚合48 h。組織切片后，40 g/L醋酸鈾染色20 min，27 g/L硝酸鉛染色20 min。在倒置顯微鏡下觀察髓核組織切片中凋亡細胞形態(tài)及生長情況。另外，收集不同代次髓核細胞，當細胞融合達80%時用細胞刮刀刮取細胞，常規(guī)透射電子顯微鏡下制樣處理，電子顯微鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3.4低氧環(huán)境下髓核細胞凋亡的檢測取生長良好的第2代髓核細胞，融合率達90%時進行傳代，接種于96孔板(5000細胞/孔)，以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)6～8 h。待細胞貼壁后，隨機分為2組：正常對照組和低氧組，每組設(shè)置3個復孔。低氧組以130 μmmol/L去鐵草酰胺(defetoxamine，DFX)處理細胞，誘導低氧狀態(tài)；正常對照組為未經(jīng)處理的正常氧分壓狀態(tài)下細胞。24 h后兩組細胞均更換成不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，采用MTT法檢測細胞增殖情況。每孔加入10 μL MTT液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后離心去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩5 min，用酶標儀檢測波長570 nm處各孔的吸光值。細胞存活率=實驗組吸光值/對照組吸光值×100%。

同時，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)測定法檢測髓核細胞凋亡情況。按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒提供的說明書步驟進行檢測，結(jié)果以細胞核中有棕色顆粒者為凋亡陽性細胞[4]。在400倍鏡下，隨機觀察10個視野，記錄陽性細胞數(shù)，以平均100個細胞中包含凋亡細胞的個數(shù)為凋亡指數(shù)(apopotic index，AI)。

1.3.5不同循環(huán)流體靜壓下髓核細胞凋亡的檢測取生長良好的第2代髓核細胞，融合率達90%時進行傳代，接種于96孔培養(yǎng)板(1×104細胞/孔)。細胞培養(yǎng)3～5 d后，將細胞隨機分為3組：不加壓對照組、加壓50 kPa組和加壓100 kPa組。在可控壓力細胞加載裝置中加載細胞，加壓1 h后進行髓核細胞凋亡檢測。按TUNEL細胞凋亡檢測說明書進行，結(jié)果以細胞核中有棕色顆粒者為凋亡陽性細胞。在400倍鏡下，隨機觀察10個視野，記錄陽性細胞數(shù)，并計算凋亡細胞陽性率。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1髓核細胞凋亡形態(tài)用電子顯微鏡觀察髓核細胞形態(tài)，各標本中均能找到凋亡細胞。凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核中染色質(zhì)固縮，集聚至核周邊呈月牙型斑塊；細胞質(zhì)濃縮，與細胞膜融合形成膜表面泡狀突起；受損細胞體積縮小，與臨近正常細胞脫離，細胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體。

2.2低氧狀態(tài)下髓核細胞凋亡情況MTT法檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，低氧狀態(tài)下髓核細胞的存活率較高。TUNEL法檢測結(jié)果則顯示，低氧處理后髓核細胞中凋亡細胞數(shù)減少。

2.3不同流體靜壓下髓核細胞凋亡情況PCR檢測并計算不同流體靜壓下髓核細胞的凋亡率，結(jié)果顯示，加壓100 kPa組凋亡率為37.87%，加壓50 kPa組為8.40%，對照組為6.22%。本研究的統(tǒng)計分析表明，50 kPa壓力組與對照組相比，髓核細胞凋亡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而100 kPa壓力組與對照組相比，髓核細胞凋亡率前者增加31.65%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3討論

椎間盤退變是由于椎間盤內(nèi)髓核組織的營養(yǎng)供應(yīng)不足，髓核退變后脫出，壓迫周圍組織，從而引起一系列不適癥狀。在椎間盤退變的病因?qū)W研究中，細胞凋亡的作用越來越引起人們的重視。髓核細胞是腰椎間盤組織中維持正常代謝的重要成分，有合成和修復細胞外基質(zhì)等重要功能。髓核細胞退變導致腰椎間盤組織中正常髓核細胞減少，細胞凋亡增加。由于細胞凋亡在椎間盤退變中起重要作用，人們推測可通過抑制細胞凋亡以及利用干細胞和組織工程學的方法來延緩椎間盤退變[5]。近年來，有學者從組織工程學角度對椎間盤退變中髓核細胞的凋亡機制進行了一系列相關(guān)研究。其中，Gruber等[6]發(fā)現(xiàn)，椎間盤細胞培養(yǎng)液中血清撤除誘導的細胞凋亡能夠被胰島素生長因子1以及血小板衍生生長因子緩解。Wang等[7]分離小鼠頸椎間盤軟骨終板細胞進行培養(yǎng)，向培養(yǎng)液中加入Fas單克隆抗體時，Bax表達增加，Bcl-2表達水平下降，凋亡細胞增加；而向培養(yǎng)液中加入胰島素生長因子1可以阻斷Fas單克隆抗體引起的上述改變。Park等[8]研究發(fā)現(xiàn)，可通過caspase抑制劑來抑制椎間盤細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧狀況下退變髓核細胞中存活細胞數(shù)比對照組增加，提示體外培養(yǎng)的髓核細胞能夠很好地適應(yīng)低氧環(huán)境。有研究[3]報道，低氧環(huán)境能夠保持正常髓核細胞的形態(tài)，使其持續(xù)表達類軟骨表型標志物蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，同時低水平表達Ⅰ型膠原，表現(xiàn)為低度的去分化狀態(tài)。椎間盤組織為無血管組織，細胞的代謝主要為無氧代謝，能量來源于糖酵解。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境下細胞凋亡數(shù)目明顯減少；同時在50 kPa壓力下凋亡細胞數(shù)變化不明顯，而100 kPa壓力下凋亡細胞數(shù)明顯增加，說明100 kPa壓力對細胞凋亡作用明顯。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低氧和低壓力環(huán)境可以減少髓核細胞凋亡的發(fā)生，為今后臨床上開展通過抑制髓核細胞凋亡來治療退變性椎間盤疾病的研究提供了初步的理論基礎(chǔ)。

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Change of Apoptosis of Human Nucleus Pulposus Cells Cultured in Vitro under Hypoxic Condition and Diffe-rent Hydrostatic Pressure

WANGYonggui1LIUJiangtao1XUJunchang1ZHUANGZhengling1LIUTao1LIUChang2

1.DepartmentofOrthopedics,XiangyangHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Xiangyang441021,China; 2.DepartmentofSurgery,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200000,China

AbstractObjective：To observe the change of apoptosis of nucleus pulposus cells cultured in vitro under hypoxic condition and different hydrostatic pressure. Methods:The human degenerative nucleus pulposus cells were cultured in vitro and randomly divided into 2 groups according to hypoxic condition: the hypoxia group and the normal oxygen partial pressure group. While the nucleus pulposus cells were randomly divided into three groups according to different hydrostatic pressure: the control group without pressure, the 50 kPa pressure group and the 100 kPa pressure group. The change of apoptosis of nucleus pulposus cells was detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method and terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay. Results: As compared with that in normal oxygen partial pressure group, the proportion of survival nucleus pulposus cells in hypoxic group increased, while the number of apoptotic cells decreased. Under different hydrostatic pressure, there was no statistically significant difference regarding the apoptotic positive rate of nucleus pulposus cells between the 50 kPa pressure group and the control group (P>0.05). However, the apoptosis positive rate in the 100 kPa pressure group increased by 31.65%, compared with that in the control group, and the difference was statistically significant (P<0.01). Conclusions: Hypoxic condition, as well as low pressure condition, can reduce the occurrence of apoptosis of nucleus pulposus cells.

Key WordsIntervertebral disc degeneration；Apoptosis；Cell hypoxia；Hydrostatic pressure

通訊作者劉江濤，E-mail：Ljt@sina.com

基金項目：湖北省襄陽市科技局資助項目(編號：BK2014107)

中圖分類號R681.53

文獻標識碼A