王少兵, 田 兵，操冰冰，李 竣

(中南民族大學 藥學院，武漢 430074)

龍血竭總黃酮提取工藝的優(yōu)化

王少兵, 田 兵，操冰冰，李 竣

(中南民族大學 藥學院，武漢 430074)

為優(yōu)選龍血竭總黃酮提取工藝，通過單因素考察和正交試驗[L9(34)正交表]進行篩選，考察了提取溶劑、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)4種主要因素對提取物中總黃酮含量的影響，確定了龍血竭總黃酮的最佳提取工藝.結(jié)果表明：以乙酸乙酯為提取溶劑，10倍溶劑70 ℃下回流提取0.5 h，提取1次，獲得提取物中總黃酮質(zhì)量百分比為54.6.1%，此法可為龍血竭總黃酮的制劑研究奠定基礎(chǔ).

龍血竭；總黃酮；正交試驗；提取工藝

龍血竭是百合科劍葉龍血樹Dracaenacochinchinensis(Lour.) S. C. Chen的含脂木材經(jīng)乙醇提取得到的樹脂，其基源植物主要分布在越南、老撾和柬埔寨等東南亞國家，在我國主要分布在云南和廣西[1].現(xiàn)代藥理學研究表明：龍血竭具有活血止血、抗氧化、抗細菌等多種藥理活性[2]，所含化學成分主要有黃酮類、萜類、甾體類等[3]，其中以龍血素A、龍血素B為代表的二氫查爾酮類黃酮化合物為其主要活性物質(zhì)[4].目前關(guān)于龍血竭總黃酮的提取工藝和制劑研究報道較少[5,6]，為提高龍血竭產(chǎn)品質(zhì)量并使之更好地發(fā)揮治療作用，本文采用單因素考察和正交設(shè)計試驗，探討了龍血竭中總黃酮成分的提取工藝，為龍血竭總黃酮的制劑研究和產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

紫外可見分光光度計(Lambda 35, 美國Perkin Elmer公司)，電子天平(CP214,上海奧豪斯儀器有限公司)，真空干燥箱(ZKXFB-2, 上海樹立儀器儀表有限公司)，龍血竭(西雙版納版納藥業(yè)有限公司, 批號120127)，乙醇(國藥集團化學試劑有限公司, 批號20150108)，乙酸乙酯(天津博迪化工股份有限公司, 批號20140927)，龍血素B對照品由中南民族大學生物醫(yī)學工程學院陳素老師提供，純度98.5%以上.

1.2 分析方法的建立

1.2.1 檢測波長的選擇

配制龍血素B對照品溶液和樣品溶液，于220～400 nm處掃描，紫外吸收圖譜見圖1.由圖1可見，龍血素B的紫外吸收曲線與龍血竭提取物吸收曲線基本一致，且在277 nm處有明顯吸收峰，故選擇277 nm作為龍血竭總黃酮的檢測波長[7].

1.2.2 線性關(guān)系的考察

精密稱取12.4 mg龍血素B對照品，置于100 mL容量瓶中，加70 %乙醇溶解并定容，分別量取0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mL置于25 mL容量瓶中，加70 %乙醇定容至刻度，于277 nm處測量吸光度，以對照品濃度C(μg·mL-1)為橫坐標x，吸光度A為縱坐標y，繪制標準曲線，回歸方程為y= 50.3038x- 0.0219，相關(guān)系數(shù)r= 0.9995，表明龍血素B在1.24 ～12.4 μg·mL-1范圍線性良好.

1.2.3 總黃酮的測定

精密稱取干燥至恒重的龍血竭提取物50 mg，置于100 mL的容量瓶中，加入70 %乙醇溶解并定溶，量取1 mL溶液置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定溶至刻度，于277 nm處測量吸光度，計算提取物中總黃酮的質(zhì)量百分比.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察

2.1.1 提取溶劑的考察

取龍血竭藥材10 g，分別加入乙酸乙酯, 90 %乙醇, 80 %乙醇, 70 %乙醇100 mL，70 ℃下回流提取1 h，過濾，減壓濃縮，干燥，測定提取物中總黃酮的含量.結(jié)果表明：以乙酸乙酯作為提取溶劑優(yōu)于各濃度乙醇溶液，故選用乙酸乙酯為提取溶劑.

2.1.2 料液比的考察

取龍血竭藥材10 g，分別按1∶8, 1∶10, 1∶12, 1∶14和1∶16 (v/w)加入乙酸乙酯，70 ℃回流1 h，過濾，減壓濃縮，干燥，測定提取物中總黃酮的含量(結(jié)果見圖2).圖2顯示：料液比為1∶10時提取物中總黃酮的含量最高.

2.1.3 提取溫度的考察

取龍血竭藥材10 g，用10倍量乙酸乙酯回流1 h，提取1次，提取溫度分別為60 ℃, 70 ℃, 80 ℃, 90 ℃, 100 ℃，提取后過濾，減壓濃縮，干燥，測定提取物中總黃酮的含量(見圖3).結(jié)果表明：溫度為70 ℃時候提取物中總黃酮的含量最高.

2.1.4 提取時間的考察

龍血竭藥材10 g，用10倍量的乙酸乙酯70 ℃下提取1次，提取時間分別為0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 h，提取后過濾，減壓濃縮，干燥，測定提取物中的總黃酮含量(見圖4).結(jié)果表明：提取0.5 h總黃酮的含量最大，隨著時間的增加提取物中總黃酮的含量略有下降.

2.1.5 提取次數(shù)對提取物總黃酮含量的影響

取10 g龍血竭藥材，用乙酸乙酯70 ℃回流提取1 h，分別提取1, 2, 3, 4次，過濾，減壓濃縮，干燥，測定提取物中的總黃酮含量(見圖5).

結(jié)果表明：提取1次時總黃酮含量最高，隨著提取次數(shù)的增加提取物中總黃酮的含量降低.

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以乙酸乙酯為提取溶劑，考察料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)4個因素，每個因素3個水平(見表1).

按照因素水平表進行正交試驗，正交試驗結(jié)果如表2和表3.由極差分析可知：影響龍血竭總黃酮提取工藝的因素順序為B>A>D>C，即料液比>提取溫度>提取時間>次數(shù)；方差分析中，以影響因素最小的一項作為誤差項，所得結(jié)果與極差分析結(jié)果一致，即影響龍血竭總黃酮提取工藝的因素順序為B>A>D>C，因素B具有顯著性，因素A、C、D無顯著性.盡管因素A無顯著性差異，但在單因素試驗中由A1和A2工藝得到的總黃酮含量分別為49.3%和51.9%，綜上考慮選擇工藝為A2B2C1D1，即料液比為1∶10，提取溫度為70 ℃，提取時間為0.5 h，提取次數(shù)為1次.

F0.05(2,2)=19

按照正交試驗的優(yōu)選工藝提取龍血竭總黃酮，重復試驗3批，龍血竭提取物中總黃酮平均含量達54.61%(見表4).

3 討論

目前關(guān)于龍血竭總黃酮提取工藝的研究很少.屠鵬飛等[6]采用乙酸乙酯提取和堿溶酸沉的方法提取了龍血竭中總黃酮，利用正交試驗考察了乙酸乙酯用量、提取次數(shù)、提取時間和NaOH用量.但對于中藥的提取純化工藝，不同工藝過程的影響因素較多，將它們安排在同一個正交試驗表內(nèi)，不能充分考察各影響因素的影響，難以說明工藝的合理性[8]，故不宜將堿溶酸沉的影響因素安排在提取工藝的正交試驗表中.

據(jù)文獻報道，總黃酮含量測定多數(shù)以蘆丁為對照品，采用Al(NO3)3-NaNO2比色法在510 nm處進行測量[9,10]，但此法用于龍血竭總黃酮的測定存在較大誤差[11]，因為龍血竭中黃酮成為主要為二氫查爾酮類，但蘆丁結(jié)構(gòu)為黃酮醇類，兩者的紫外吸收曲線差異較大，且龍血竭總黃酮在510 nm處吸收強度非常弱.鑒于龍血素B為龍血竭中主要活性成分，中國藥典及國家標準[WS3-082(Z-016)-99(Z)]中均規(guī)定需以龍血素B為控制指標，故試驗中選擇以龍血素B為對照品，利用紫外法來測定龍血竭中總黃酮含量.

通過正交試驗優(yōu)選出龍血竭總黃酮提取工藝為：料液比為1︰10，提取溫度為70 ℃，提取時間為0.5 h，提取次數(shù)為1次. 按照該優(yōu)選工藝對龍血竭總黃酮進行三次提取，總黃酮平均提取率為70.94%，提取物中總黃酮的質(zhì)量百分比為54.61%，滿足《藥品注冊管理辦法》中中藥5類新藥關(guān)于植物藥提取的有效部位含量的要求.與很多其他中藥的提取工藝相比，本優(yōu)選工藝中提取時間偏短、提取次數(shù)偏少，主要由于龍血竭本身是龍血樹含脂木藥材的乙醇提取物，故用乙酸乙酯從龍血竭中提取總黃酮，其提取相對較容易.在龍血竭總黃酮的提取工藝中，提取溫度對總黃酮含量具有顯著影響，由于黃酮類成分的熱穩(wěn)定性比較差，溫度過高容易導致氧化或分解所致[12,13].

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Optimization of the Extraction of Total Flavonoids fromResinaDraconis

Wang Shaobing, Tian Bing, Cao Bingbing, Li Jun

(School of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China )

To optimize the extraction process of total flavonoids fromResinaDraconis, single factor investigation and orthogonal test—a L9(34) orthogonal table were used by considering four major factors: the extraction solvent, extraction temperature, extraction time and extraction cycles. The optimal extraction process was as follow: ethyl acetate as extraction solvent, 10 times ethyl acetate and one extraction for 0.5 h at 70 ℃, with the quality yield of total flavonoids of 54.61%. The study laid the foundation for the pharmaceutical formulation of the total flavonoids fromResinaDraconis.

ResinaDraconis; total flavonoid; orthogonal test; extraction technology

2015-07-24

王少兵(1977-)，男，副教授，博士，研究方向：藥物輸送系統(tǒng)與藥物制劑，E-mail：pharmawang@sina.com

湖北省民族藥物現(xiàn)代化工程技術(shù)中心開放課題資助項目(2015ZY003)；中央高校自然科學基金資助項目(CZZ15006)

284.2

A

1672-4321(2015)04-0058-04