吳云華， 方玉姣

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)和利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

水稻細(xì)胞分裂氧化酶的原核表達(dá)

吳云華， 方玉姣

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)和利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

從水稻日本晴幼葉中提取RNA，以反轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA為模板PCR擴(kuò)增得到了細(xì)胞分裂素氧化酶基因(CKO)，酶切連接到pET-28a載體上，構(gòu)建了重組載體pET-28a-CKO，在大腸桿菌BL21中表達(dá)了細(xì)胞分裂素氧化酶.

細(xì)胞分裂素氧化酶；原核表達(dá)；載體pET-28a；日本晴

細(xì)胞分裂素作為一種植物激素，是目前人們已經(jīng)知道的5大類(lèi)植物激素(即生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯)之一，它具有腺嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu).這類(lèi)物質(zhì)的共同特點(diǎn)是在腺嘌呤環(huán)的第六位置氨基上有特定的取代物，對(duì)細(xì)胞的分裂、芽的分化、側(cè)芽的發(fā)育、果實(shí)的發(fā)育等起重要作用.植物中細(xì)胞分裂素(CTK)[1]的分解，很大程度上依賴(lài)于一種特殊酶的作用實(shí)現(xiàn).這種酶以分子氧為氧化劑，催化CTK的N6上不飽和側(cè)鏈裂解而使其徹底喪失活性，此反應(yīng)不可逆，這種酶是細(xì)胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase，CKO)，它能作用于體內(nèi)CTK代謝和調(diào)節(jié)CTK與生長(zhǎng)素之間的平衡等.

玉米[2]、擬南芥[3]、石斛蘭[4]、大麥[5]、小麥[6]等的細(xì)胞分裂素氧化酶基因目前已經(jīng)被克隆.轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明：通過(guò)改變植物細(xì)胞分裂素氧化酶基因的表達(dá)可以調(diào)控內(nèi)源激素CTK的含量，進(jìn)而影響植物的發(fā)育.Ashikari M等[7]發(fā)現(xiàn)在水稻花序分生組織中的細(xì)胞分裂素氧化酶基因OsCKX2的表達(dá)受抑制時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂素水平增加、發(fā)育旺盛、穗粒數(shù)明顯增多，從而提高水稻產(chǎn)量.但目前關(guān)于水稻細(xì)胞分裂素氧化酶CKO的原核表達(dá)并未見(jiàn)報(bào)道，本文利用pET-28a為載體，探索水稻細(xì)胞分裂素氧化酶CKO在大腸桿菌BL21中的表達(dá)，為細(xì)胞分裂素氧化酶CKO生物傳感器的制備和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

水稻日本晴種子、載體pET-28a、大腸桿菌E.coli.DH5α和E.coli.BL21(DE3) 由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)和利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供. Trizol Reagent(Ambion)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo scientific)，限制性?xún)?nèi)切酶NdeI、EcoR I、XhoI, T4 DNA連接酶、DNA Maker、蛋白Maker(TaKaRa)，KOD-plus-試劑盒(TOYOBO司)，DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔回收試劑盒(AXYGEN)，卡那霉素(上海生工公司)，二硫蘇糖醇(DTT)和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG, Alfa Aesar)，苯甲基硫酰氟(PMSF,丁香園)，引物合成和基因測(cè)序(擎科生物有限公司)，其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)和天津市廣成化學(xué)試劑有限公司等的分析級(jí)AR試劑.

PBS緩沖液(pH 7.0, 1 L)：0.27 g KH2PO4，1.42 g Na2HPO4，8 g NaCl，0.2 g KCl，加ddH2O至900 mL混勻，調(diào)節(jié)pH至7.0，再加ddH2O定容至1L，高壓滅菌.Buffer A(1 L)：171.1 g蔗糖，0.186 g EDTA·2Na，12.1 g Tris溶于900 mL ddH2O混勻，用冰乙酸調(diào)pH至7.6，再定容至1 L，過(guò)濾除菌，存于4℃?zhèn)溆? Buffer B(1 L)：加少量ddH2O溶解1.286 g四水乙酸鎂，加入200 mL甘油，13.4 mL 1mol/L KH2PO4, 86.8 mL 1mol/L K2HPO4，加ddH2O至900 mL混勻，調(diào)節(jié)pH至7.6，再加ddH2O定容至1L，存于4℃?zhèn)溆肹8].

精密電子天平(ME204E /02, 上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，PCR儀(PTC-200, 美國(guó)Bio-Rad公司)，瓊脂糖膠電泳儀(DYY-5, 北京六一儀器廠)，恒溫?fù)u床(HQ45Z, 武漢中科儀技術(shù)有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(TEL-40Gelvue UV Transilluminator, 英國(guó))，核酸蛋白測(cè)定儀(HD-4, 上海瀘西分析儀器廠有限公司)，PH計(jì)(pHS-3C, 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司).

1.2 原核表達(dá)載體pET-28a-CKO的構(gòu)建

用水泡適量日本晴種子，待其發(fā)芽后移栽到土中生長(zhǎng)，待長(zhǎng)出5～6片幼葉后，取日本晴新鮮幼葉，用Trizol法提取葉片的RNA，用反轉(zhuǎn)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)，用水稻Actin引物對(duì)cDNA進(jìn)行檢測(cè)，以該cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物F(5′-ATCCAT ATGGAGGTTGCCATGGTCTGC-3′)和R(5′-CCGCTCGAGGCTATAGCTTGCAAATGCGCC-3′)，設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)是XhoI和NdeI，用KOD-plus-試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增所得產(chǎn)物與質(zhì)粒pET-28a一起先用NdeI在37 ℃酶切過(guò)夜，酶切后片段用清潔回收.再分別用XhoI進(jìn)行37 ℃酶切6 h，酶切的目的片段用清潔回收，質(zhì)粒pET-28a酶切產(chǎn)物切膠回收后，用T4連接酶將載體和目的片段于16 ℃連接12 h，構(gòu)建出重組體pET-28a-CKO[9].

將重組體pET-28a-CKO和空載pET-28a分別通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞E.coli.BL21(DE3)中，其中空載作為對(duì)照，分別取200 mL菌液涂布到含抗性的LB平板(含50 μg/mL卡那霉素)上，37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)(12～18 h)，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，菌落PCR有目的帶后對(duì)應(yīng)的單克隆再提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，檢測(cè)正確的質(zhì)粒測(cè)序.鑒定正確的重組體挑取單克隆于3 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，在搖床中以37℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，將培養(yǎng)好的3 mL菌液接種于500 mL TB(含卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3 h檢測(cè)其OD值，使其OD600達(dá)到約0.6，加入1 mol/L IPTG使其終濃度為1 mmol/L，15℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)8 h.

1.3 重組蛋白的提取及SDS-PAGE、Western-blot檢測(cè)分析

于15 ℃8 h，誘導(dǎo)50 mL的菌液，菌液于4℃、5000 g離心15 min，棄上清，收集菌體.冰浴放置30 min后，在4℃、5000 g離心20 min，棄上清，收集菌體，加入Buffer A重懸 (70 mg濕細(xì)胞/ mL)，再加入與Buffer A等體積的無(wú)菌水，同時(shí)加入溶菌酶至其終濃度為0.1 mg/mL，用移液器吹打混勻，冰浴在搖床上輕搖80 r/min 30 min，于4℃、5000 g離心20 min后，棄上清，沉淀中加入Buffer B重懸(0.5 g濕細(xì)胞/mL)，并現(xiàn)加DTT至終濃度為0.01 mmol/L，備用的蛋白凍存于-80 ℃.待破碎的，加PMSF至終濃度為1 mmol/L，在冰浴條件下超聲破碎，功率為16 W，每次破碎4 s，間歇6 s，一共破碎處理約8 min，使其成為均一的液體.破碎產(chǎn)物于4℃、 14000 r/min離心10 min，吸取出上清備用，沉淀加入PBS緩沖液(pH 7.0)，在冰上放置1 h，對(duì)處理好的的上清、混合、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)和Western-blot分析檢測(cè)[10].

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段CKO的擴(kuò)增

用Trizol法從日本晴葉片提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)出產(chǎn)物cDNA，用水稻actin引物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖1)正確，可作為擴(kuò)增模板用于目的片段的擴(kuò)增.

以檢測(cè)好的cDNA為模板，用KOD-plus-酶擴(kuò)增CKO片段，由于第1次擴(kuò)增的片段很弱，以第1次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2次PCR條件摸索后，第2次PCR產(chǎn)物的濃度可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖2).

2.2 構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-CKO

提取載體質(zhì)粒pET-28a，用EcoR I單酶切檢測(cè).用NdeI分別酶切目的片段和載體質(zhì)粒pET-28a，37℃過(guò)夜，回收第一次酶切產(chǎn)物；再用XhoI酶切6h，將第二次酶切的產(chǎn)物回收后，用T4連接酶16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物和空載pET-28a分別熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞.對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行構(gòu)建載體重組體的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)如圖3.

將構(gòu)建好的載體經(jīng)菌落和質(zhì)粒PCR檢測(cè)，目的片段大小約為1500 bp，再將重組載體用NdeI和XhoI雙酶切檢測(cè)，結(jié)果顯示有約5500 bp和1500 bp的條帶(見(jiàn)圖4)，將鑒定正確的重組載體測(cè)序，測(cè)序結(jié)果100%正確，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.3 CKO蛋白的SDS-PAGE和Western-blot分析

15 ℃下用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)原核表達(dá)菌體表達(dá)8 h，以空載pET-28a為對(duì)照，誘導(dǎo)蛋白通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，與對(duì)照相比，可見(jiàn)蛋白大小在55～70 kDa，進(jìn)一步進(jìn)行Western-blot分析檢測(cè)，分析結(jié)果在55～70 kDa處有帶His標(biāo)簽的融合蛋白，該蛋白就是目的蛋白CKO，說(shuō)明CKO重組蛋白成功得到了表達(dá)(見(jiàn)圖5).

3 結(jié)語(yǔ)

本研究利用水稻日本晴為材料，成功構(gòu)建了pET-28a-CKO重組載體, 采用大腸桿菌菌株BL21(DE3)作為表達(dá)菌株，實(shí)現(xiàn)了水稻細(xì)胞分裂素氧化酶(CKO)的原核表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)和Western-blot分析，目的蛋白獲得了成功表達(dá).本研究為后續(xù)結(jié)合納米材料放大效應(yīng)，構(gòu)建相應(yīng)的生物傳感器和蛋白生理功能研究奠定了基礎(chǔ).

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Study on the Prokaryotic Expression of Rice Cytokinin Oxidase

Wu Yunhua, Fang Yujiao

(Key Laboratory for Biotechnology of National Commission for Nationalities, College of Life Science, South Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

The total RNA from var nipponbare was extracted and the cytokinin oxidase gene (CKO) was amplified by PCR using the reverse product cDNA as template, thenCKOwas ligated to vector pET-28a after restriction and a recombinant plasmid pET 28a-CKOwas constructed. Finally the rice cytokinin oxidase was expressed inE.coliBL21. The results showed that the recombinant plasmid pET-28a-CKOwas successfully constructed and the prokaryotic expression of rice cytokinin oxidase was achieved.

cytokinin oxidase; prokaryotic expression; pET-28a vector ; var nipponbare

2015-06-26

吳云華(1971-), 女, 教授, 博士, 研究方向: 生化分析與生物傳感，E-mail:wuyunhua@mail.scuec.edu.cn

湖北省自然基金資助項(xiàng)目 (2014CFB381)；中央高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CZW14008)

Q51

A

1672-4321(2015)04-0037-04