馮振邦李萌王宗強張卜天呂曉霞姜金蘭,4

誘導多能干細胞在組織工程修復關節(jié)軟骨損傷的研究進展

馮振邦1李萌1王宗強1張卜天2呂曉霞3姜金蘭1,4

關節(jié)軟骨位于骨骼末端，主要起承重、減震和潤滑關節(jié)的作用。由于缺乏血運，關節(jié)軟骨損傷后難以自行修復。關節(jié)軟骨損傷為臨床常見疾病，目前尚無理想的方法促進其修復和再生，而以種子細胞、支架材料和細胞生長因子為基礎的組織工程技術為關節(jié)軟骨修復開辟了新道路。誘導多能干細胞（iPSC）作為軟骨組織工程全新的種子細胞，與其他種子細胞相比，在軟骨細胞移植及體外軟骨組織和器官再造方面具有更廣闊的應用前景。隨著對iPSC的重編程機制、誘導方法、定向軟骨分化條件以及臨床應用安全性等研究的不斷深入，其應用于臨床的腳步將越來越近。

多能干細胞； 關節(jié)； 軟骨； 組織工程

關節(jié)軟骨位于骨骼末端，主要起承重、減震和潤滑關節(jié)的作用。關節(jié)軟骨屬于透明軟骨，由軟骨細胞及其分泌的細胞外基質(zhì)構成。由于缺乏血運及相應的營養(yǎng)物質(zhì)，關節(jié)軟骨損傷后，病變處不能聚集足夠的活性細胞以及分泌充足的細胞外基質(zhì)，使其難以自我修復。而當前無論是應用于臨床的治療藥物，還是一些傳統(tǒng)的外科手術以及新興的微創(chuàng)手術，均不能實現(xiàn)關節(jié)軟骨損傷完好修復的目的。組織工程技術是基于種子細胞、支架材料和細胞生長因子的新興技術，旨在利用生物活性物質(zhì)，通過體外培養(yǎng)和構建的方法，修復或再造組織和器官。因此，軟骨組織工程技術為關節(jié)軟骨損傷修復提供了更好的治療策略。當前，限制軟骨組織工程技術廣泛應用于臨床的障礙之一便是種子細胞的選擇問題。理想的種子細胞應滿足以下要求：（1）來源豐富，取材方便；（2）體外有較強的增殖和定向分化能力，且能保持細胞表型不變；（3）能適應受區(qū)環(huán)境和支架材料，與支架材料接種后能保持較高的黏附率；（4）能方便地通過分子生物學技術進行基因修飾；（5）植入體內(nèi)可完全替代缺失細胞，保持修復組織的表型；（6）保證臨床應用安全性，無明顯的免疫排斥和其他潛在的危險等［1］。而全新的種子細胞—誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell， iPSC）的出現(xiàn)，為軟骨組織工程技術廣泛應用于臨床治療關節(jié)軟骨損傷奠定了基礎。本文就最近幾年人iPSC（human induced pluripotent stem cell， hiPSC）的研究進展以及結合軟骨組織工程技術修復關節(jié)軟骨損傷作一綜述。

一、iPSC簡介

2006年，日本東京大學的Takahashi和Yamanaka［2］首次運用逆轉錄病毒感染技術，將Sox2、Oct3/4、Klf4和cMyc 4種轉錄因子導入小鼠胚胎成纖維細胞中，產(chǎn)生了具有胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）功能和特性的iPSC。與ESC相比，iPSC具有與其相似的細胞形態(tài)、生長特性、基因表達以及形成畸胎瘤和嵌合體等特性，并且還有來源廣泛、相對容易獲得和個體疾病特異性等優(yōu)勢，在再生醫(yī)學與組織工程學領域展現(xiàn)出了廣闊的應用前景。當前，iPSC的應用主要集中在疾病模型的建立以及藥物的開發(fā)和篩選。其中，建立動物疾病模型以研究疾病發(fā)生、發(fā)展的機制為主，為人類相關疾病治療提供依據(jù)，疾病特異性的iPSC為研究疾病機制和尋找治療新方法開創(chuàng)了新道路。新藥的發(fā)現(xiàn)及評價主要通過動物實驗進行，但人與動物之間的差異使動物實驗難以準確預測相關指標，而iPSC及其體外定向分化為其他各系細胞的特性使其在細胞水平上為新藥的藥理、藥效、毒理、藥代等研究提供了新策略。

二、不同組織來源細胞重編程為hiPSC

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種不同組織來源的細胞可以重編程為hiPSC，如皮膚成纖維細胞［3］、胚外組織細胞［4］、胚胎神經(jīng)干細胞［5］以及間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）［6］等，但獲取這些細胞的方法并不能廣泛應用于臨床。Zhou等［7］利用從尿液中收集的腎小管上皮細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后成功重編程為hiPSC，因為尿檢是臨床診療常規(guī)檢查之一，方便無創(chuàng)，所以更容易被患者接受。另外，Loh等［8］發(fā)現(xiàn)血細胞可重編程為hiPSC，雖然轉化效率相對于成纖維細胞要低很多，但臨床收集患者血細胞相對于有創(chuàng)穿刺獲取皮膚組織塊、骨髓、羊水等要更方便易行，因此這種方法更適用于臨床。最近，Hubbard等［9］和Su［10］利用非整合型附著體載體，成功將極少量外周血單核細胞重編程為hiPSC，并且操作簡便，經(jīng)濟有效，安全性高，為臨床廣泛地獲得hiPSC奠定基礎。

三、iPSC重編程安全性

逆轉錄病毒和慢病毒是最早應用于iPSC重編程的載體，它們在重編程過程中會隨機將外源基因插入到宿主細胞基因組中，從而導致插入突變，這種基因整合帶來無數(shù)的可能性，增加了體內(nèi)形成腫瘤的風險。因此，為保證iPSC的臨床應用安全性，降低致瘤風險，就應該做到避免基因整合的發(fā)生。

慢病毒和逆轉錄病毒屬于基因整合型病毒載體，為避免基因整合，可以考慮將外源基因導入到相對安全的基因位點如腺伴隨病毒整合位點-1（AAVS-1）［11］，也可以利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)［12］將導入的外源基因標記后再直接切除。使用非基因整合型病毒載體如腺病毒［13］和仙臺病毒［14］也能夠獲得無外源基因整合的iPSC。轉座子系統(tǒng)（PiggyBac［15］和Sleeping Beauty［16］）通過DNA復制或直接切除兩種方式獲得可移片段后，重新插入基因組DNA中的，該過程僅作用于DNA層面，不會在反轉錄過程中發(fā)生基因突變，因此更加簡便、安全。此外，應用非整合型附著體載體（Episomal Vectors）［9-10，17］導入重編程基因后，通過簡單的細胞培養(yǎng)就可以去除iPSC中的附加體載體，而無需任何額外的操作，被認為是當前最安全的制備iPSC的方法。

四、hiPSC相對于其他種子細胞的優(yōu)勢

目前可選擇的軟骨組織工程種子細胞有自體軟骨細胞、成體干細胞、ESC以及iPSC。軟骨細胞由于來源有限，體外擴增培養(yǎng)這一過程必不可少，而軟骨細胞在體外傳代過程中會出現(xiàn)去分化［18］，并且在軟骨缺損修復過程中可能出現(xiàn)以大量Ⅰ型膠原蛋白為主的纖維軟骨修復［19］，因此不能廣泛應用于臨床。成體干細胞如MSC雖具有良好的多向分化潛能，但也有其自身的缺點，隨著患者年齡的增長，其分化潛能會逐漸下降，在長期傳代擴增過程中會改變細胞表型，最終導致細胞自發(fā)地表型轉變［20-22］。ESC理論上在合適的調(diào)控條件下可以分化為任意類型的細胞，但ESC的倫理問題以及致瘤性當前仍無法解決，是阻礙其臨床研究及應用的主要障礙［23］。iPSC具有全能性和無限增殖性，克服了軟骨細胞和成體干細胞的缺點。并且，iPSC是由患者提供的體細胞重編程而獲得，也規(guī)避了臨床應用ESC所帶來的倫理道德問題。不僅如此，iPSC還可為臨床患者提供個體化治療方案，使用患者體細胞重編程的iPSC治療疾病時，降低了細胞及組織器官移植后發(fā)生免疫排斥的風險。因此，可以認為iPSC是軟骨組織工程極具潛力的種子細胞。

五、hiPSC向軟骨細胞誘導分化

已有報道證實，將hiPSC移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)能夠形成畸胎瘤，并且畸胎瘤中可以觀察到軟骨組織［3，24-25］，證明了hiPSC在一定條件下可以誘導分化為軟骨細胞。由于hiPSC直接進入體內(nèi)會有形成腫瘤的風險，因此，在應用于臨床治療軟骨損傷前，需要將其誘導分化為軟骨細胞。目前，傳統(tǒng)的hiPSC向軟骨細胞誘導分化的策略可歸納總結為以下三類：

1.擬胚體途徑的軟骨細胞分化：擬胚體是指體外培養(yǎng)的ESC在一定的條件下，自發(fā)形成的類似早期發(fā)育胚胎的球體結構。擬胚體的形成一般分為兩個階段，即簡單擬胚體階段和囊狀擬胚體階段，其中囊狀擬胚體具備類似胚胎發(fā)育中典型的三胚層結構，而中胚層細胞可在一定條件下向軟骨細胞系分化，擬胚體的體外分化可基本模擬體內(nèi)組織分化和發(fā)育的過程［26］。hiPSC與ESC一樣能在體外培養(yǎng)時形成擬胚體，因此hiPSC可經(jīng)擬胚體途徑向軟骨細胞分化。首先，hiPSC經(jīng)消化后制成單細胞懸液或細胞團，在擬胚體培養(yǎng)基條件下誘導其形成擬胚體；然后，將擬胚體細胞置于2D或3D條件下培養(yǎng)，并使用成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導，使其分化為軟骨細胞樣細胞［5，27-30］。該分化方法的缺點是誘導分化效率低，獲得的軟骨細胞樣細胞數(shù)量少，并且由于擬胚體會自發(fā)隨機分化而影響細胞同質(zhì)性。

2. MSC途徑的軟骨細胞分化：MSC主要源于發(fā)育早期的中胚層細胞，是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，在體外一定的誘導條件下，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等多種組織細胞。MSC途徑的軟骨細胞分化方法是采取逐步分化的策略，即先將hiPSC在體外形成擬胚體，隨后通過更換擬胚體細胞培養(yǎng)皿并使用MSC培養(yǎng)基誘導其分化為MSC樣細胞，最后通過成軟骨誘導分化培養(yǎng)基將MSC樣細胞誘導分化為軟骨細胞樣細胞［31-33］。該方法獲得高純度的MSC樣細胞需經(jīng)過多次傳代分選，操作相對繁瑣，并且仍需要經(jīng)歷擬胚體階段。而在另一項研究中，Liu等［34］將hiPSC單層培養(yǎng)在纖維狀仿生結構Ⅰ型膠原蛋白涂層的培養(yǎng)皿上，利用加有胎牛血清、抗壞血酸磷酸酯鎂鹽和地塞米松的alpha-MEM培養(yǎng)基誘導hiPSC分化，直接獲得了大量MSC樣細胞。此外，Chen等［35］將hiPSC培養(yǎng)于含有TGF-β1通路抑制劑SB431542的無血清培養(yǎng)基中，10 d后，再加入傳統(tǒng)MSC培養(yǎng)基，同樣獲得了具有多向分化功能的MSC樣細胞。這種將hiPSC一步分化為MSC的方法不僅操作簡便、高效，還避開了擬胚體階段的自發(fā)隨機分化。

3. hiPSC與原代軟骨細胞共培養(yǎng)：細胞共培養(yǎng)是指將兩種或兩種以上的細胞共同培養(yǎng)在同一環(huán)境中，使輔助細胞可以誘導目的細胞向輔助細胞或向另一種細胞分化。原代軟骨細胞分泌的多種生長因子可促進hiPSC向軟骨細胞誘導分化，并且共培養(yǎng)技術還相對真實地模擬了細胞體內(nèi)生長環(huán)境，其結果與體內(nèi)試驗更為接近。Qu等［36］在無飼養(yǎng)層細胞條件下，使用插入式Transwell將hiPSC與原代軟骨細胞共培養(yǎng)，加入軟骨細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，成功獲得了軟骨細胞樣細胞。Wei等［37］先將慢病毒介導轉染的TGF-β1/hiPSC培養(yǎng)在海藻酸鈉支架上形成細胞支架復合結構，然后再將其和原代軟骨細胞共培養(yǎng)于插入式Transwell中，加入成軟骨誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，同樣得到了軟骨細胞樣細胞。共培養(yǎng)方法的誘導分化效率主要決于原代軟骨細胞的質(zhì)量，而健康的軟骨細胞來源有限，且提取過程需有創(chuàng)操作，所以并不能廣泛應用于臨床。

而最近Yamashita等［38］建立了一種新的分化方法：首先將hiPSC在無飼養(yǎng)層細胞條件下培養(yǎng)于Matrigel基質(zhì)涂層培養(yǎng)板上；隨后利用Wnt3a和激活素A誘導hiPSC分化為中內(nèi)胚層細胞；繼而將培養(yǎng)基更換為加有抗壞血酸、BMP-2、TGF-β1和GDF-5的基礎培養(yǎng)基誘導其向軟骨細胞分化；14 d后挑選出分化的細胞團轉為無支架懸浮培養(yǎng)對其純化，繼續(xù)培養(yǎng)后，最終可獲得同質(zhì)的的透明軟骨細胞微粒。該方法操作簡單，適用于多種hiPSC系，并且獲得的軟骨細胞為表達Ⅱ型膠原蛋白（而不表達Ⅰ型膠原蛋白）的純化透明軟骨細胞，不僅可以有效修復關節(jié)軟骨損傷，還降低了臨床應用風險。

六、hiPSC與關節(jié)軟骨修復

自體軟骨細胞移植是指從負重較小的關節(jié)處提取軟骨組織塊，經(jīng)酶消化為軟骨細胞后體外增殖培養(yǎng)，再移植到軟骨病變處修復關節(jié)軟骨損傷［39］。現(xiàn)已證明，自體軟骨細胞移植在治療關節(jié)軟骨損傷類疾病尤其是膝關節(jié)損傷具有很好的療效［40-42］。但是，健康的自體軟骨細胞來源畢竟有限，若關節(jié)軟骨缺損范圍較大，考慮到軟骨細胞體外培養(yǎng)的去分化現(xiàn)象，則無法獲得足夠數(shù)量的軟骨細胞來滿足臨床需求。并且，自體軟骨細胞移植的療效還取決于軟骨細胞的質(zhì)量，而年齡因素會直接影響軟骨細胞的質(zhì)量。因此，自體軟骨細胞移植并不適用于每一位臨床患者。

hiPSC作為軟骨組織工程極具潛力的種子細胞，其多項優(yōu)勢能夠彌補自體軟骨細胞的缺點。并且大量動物實驗表明，利用hiPSC完全可以修復關節(jié)軟骨損傷。Uto等［43］通過在小鼠關節(jié)軟骨缺損處移植入iPSC和明膠混合物后，在缺損處可觀察到軟骨關節(jié)面再生，而在種屬不匹配組（iPSC與宿主遺傳背景有差異）和高濃度iPSC組則形成了畸胎瘤。說明了iPSC在體內(nèi)可以形成軟骨樣組織修復關節(jié)軟骨缺損，但直接移植iPSC和微小的種屬不匹配可能有致瘤風險。而hiPSC可以由患者自身體細胞重編程后生成，沒有種屬差異，經(jīng)體外分化為軟骨細胞后再移植可以降低致癌風險。Ko等［27］將hiPSC在海藻酸鈉水凝膠中培養(yǎng)并誘導hiPSC定向軟骨細胞分化，隨后將分化的hiPSC與海藻酸鈉水凝膠復合物移植入關節(jié)軟骨缺損的免疫缺陷小鼠模型中，12周后在缺損處觀察到表面光滑、附著牢固的軟骨樣組織，成功地修復了關節(jié)軟骨缺損，并且新生軟骨組織大部分由移植的hiPSC構成。充分證明了hiPSC源性軟骨細胞能夠在體內(nèi)修復關節(jié)軟骨損傷。此外，Yamashita等［38］將純化的hiPSC源性透明軟骨細胞微粒移植入嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠和免疫抑制迷你豬的關節(jié)軟骨缺損處，新生軟骨得以存活，并與宿主關節(jié)軟骨相互融合，不但成功地修復了關節(jié)軟骨缺損，還沒有異位組織和腫瘤形成，保證了hiPSC臨床應用的安全性。并且，迷你豬體內(nèi)實驗的結果還表明hiPSC可適用于大型動物，預示著人類關節(jié)軟骨損傷同樣可以被hiPSC修復。

再生醫(yī)學與組織工程學的最終目標是體外再造出功能性組織和器官。理論上講，人類器官可以通過在缺失某一特定器官的動物胚囊內(nèi)移植hiPSC后再生而獲得。現(xiàn)已證明在缺失胰腺組織的（Pdx1基因缺失）小鼠胚囊移植入小鼠iPSC后可以使小鼠胰腺再生［44］。但這種方法不僅面臨許多倫理問題，還因為再生組織器官的血管結構是由原宿主體內(nèi)生成，將其移植到新宿主體內(nèi)有可能發(fā)生免疫排斥反應而備受爭議。軟骨組織工程支架作為軟骨細胞外基質(zhì)的替代物，不僅為細胞提供適宜的生存環(huán)境，還能誘導和調(diào)控細胞的分化，形成全新的功能性組織器官。因此，軟骨組織工程支架完全可以替代宿主動物成為hiPSC載體，不但可以搭載細胞進行細胞移植，還可以經(jīng)體外適宜條件下培育出新的軟骨組織。此外，軟骨組織不含有血管，不會發(fā)生移植免疫排斥反應，并且相對于其他組織器官，關節(jié)軟骨結構簡單，體外培育也容易得多。所以說，利用軟骨組織工程支架材料，將hiPSC體外培養(yǎng)出軟骨組織器官后直接移植完全可行。雖然當前還無法實現(xiàn)hiPSC體外軟骨組織和器官的再造，但隨著再生醫(yī)學與組織工程技術的發(fā)展，各種新型軟骨組織工程仿生支架的出現(xiàn)，基于hiPSC的體外軟骨組織和器官再造將成為可能。

綜上所述，hiPSC在應用于臨床修復關節(jié)軟骨損傷方面可考慮以下策略，首先把患者提供的細胞（外周血有核細胞、尿液細胞等）經(jīng)安全高效的重編程方法獲得hiPSC，然后體外大量擴增以備于需要大量細胞來修復比較大的軟骨缺損，再將其誘導分化為軟骨細胞，最后與軟骨組織工程支架材料相結合，用于軟骨細胞移植；也可以將hiPSC利用軟骨組織工程技術，直接體外培育出功能性軟骨組織和器官，用于組織器官移植修復關節(jié)軟骨損傷。

七、結語

目前，雖然iPSC在臨床應用方面仍處于起步階段，但隨著廣大科研工作者對其不斷地鉆研和努力，已取得重大進展。尤其是在2013年7月，日本厚生勞動省正式批準日本理化學研究所等機構實施iPSC臨床治療研究。次年9月，該省又批準了應用iPSC制成的視網(wǎng)膜細胞進行眼科疾病治療的臨床研究，并由眼科專家Ttakahashi對6例滲出型老年性黃斑變性患者進行了iPSC源性的視網(wǎng)膜細胞移植手術，這為iPSC應用于臨床邁出了十分重要的一步。雖然iPSC在軟骨組織工程中具有廣闊的應用前景，但要實現(xiàn)其廣泛應用于臨床的目標還有很長的路要走。隨著對iPSC重編程分子機制的探索，重編程方法的改進，定向誘導分化的精確調(diào)控，大型動物試驗和人體試驗的證據(jù)填補，以及相關法律法規(guī)的批準，相信iPSC會逐漸應用于臨床，為醫(yī)學界帶來新的希望。

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Progress of iPSCs in articular cartilage injury repairing with tissue engineering technology

Feng Zhenbang1， Li Meng1， Wang Zongqiang1， Zhang Butian2， Lyu Xiaoxia3， Jiang Jinlan1，4，1Department of Orthopedic Surgery，2Department of Radiology，4Scientific Research Center，China-Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 130033， China；3Central Laboratory of Shandong Provincial Hospital， Jinan 250021， China

Jiang Jinlan， Email：jiangjl2003@hotmail.com

Locating at the ends of bone， articular cartilage provides weight bearing，shock absorption and lubrication to the diarthrodial joints. Articular cartilage has no blood vessels， and thus has poor self-repairing capacity after being damaged. Articular cartilage injury is common in clinical settings and there are no ideal treatments which can effectively improve the cartilage regeneration. Recently， the emergence and development of tissue engineering technology based on seed cells， scaffolds and growth factor provides a new approach for the repair of articular cartilage injury. Induced pluripotent stem cell（iPSC）， a new kind of seed cell for cartilage tissue engineering， shows overwhelming advantages for chondrocyte，cartilage tissue or organ regeneration over the other seed cells. With the rapid development of tissue engineering technology and breakthroughs made in iPSC research field， such as a better understanding of cellular reprogramming mechanism， the optimization of the methods for chondrogenic differentiation， the iPSC and tissue engineering technology will be used for articular cartilage injury in the foreseeable future.

Multipotent stem cells； joints； cartilage； tissue engineering

2015-05-12）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.010

吉林省衛(wèi)生計生科研計劃（20142037）

130033 長春，吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科1，放射科2，科學研究中心4；250021 濟南，山東省立醫(yī)院中心實驗室3

姜金蘭，Email：jiangjl2003@hotmail.com