王振宇周慶軍史偉云

多能干細(xì)胞向角膜上皮分化的研究進(jìn)展

王振宇1，2周慶軍2史偉云2

許多患者因眼表疾病而遭受視力損害，角膜或角膜緣干細(xì)胞移植是這類患者重建光明的希望，但由于供體材料短缺，限制了其臨床應(yīng)用，使很多患者無法得到有效的治療。隨著多能干細(xì)胞分化研究的深入，已有多種方法將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，利用多能干細(xì)胞產(chǎn)生角膜上皮組織供臨床移植成為解決這一問題的思路之一。本文總結(jié)近年來誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為角膜上皮樣細(xì)胞的研究進(jìn)展，并在此基礎(chǔ)上對分化細(xì)胞的純化鑒定、安全性和臨床應(yīng)用所面臨的問題等進(jìn)行討論。

多能干細(xì)胞； 上皮，角膜； 細(xì)胞分化； 角膜緣

根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)，全球約有上千萬人因各類角膜疾病遭受視力損害甚至失明，造成個人、家庭嚴(yán)重的身心損害及社會沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，成為繼白內(nèi)障后第二大類致盲性眼病，尤其是在發(fā)展中國家和經(jīng)濟欠發(fā)達(dá)地區(qū)［1］。其中，很多患者的視力損害是由于角膜緣干細(xì)胞缺陷（limbal stem cells defi ciency， LSCD）所造成。角膜緣干細(xì)胞（limbal stem cell， LSC）是一群位于角膜緣深部的干細(xì)胞，能夠自我更新和分化為角膜上皮細(xì)胞，對于維持角膜上皮完整、阻止結(jié)膜侵入至關(guān)重要?；瘜W(xué)傷、熱燒傷及Stevens-Johnson綜合征等原因造成的眼表損傷常引起LSC的衰竭，造成LSCD，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)：角膜上皮反復(fù)缺損、糜爛、潰瘍、角膜結(jié)膜化、新生血管長入及假性胬肉形成，最終造成視力損害［2］。

對于LSCD造成的眼表損害，目前常見的治療有自體（異體）角膜緣移植、體外培養(yǎng)的LSC移植、體外培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞移植、自體（異體）結(jié)膜移植、羊膜移植等。雖然臨床上取得了一定的療效，但仍然存在材料來源有限、易對供體造成損害、異體排異反應(yīng)、對于重癥患者療效有限等問題［3-4］。而以多能干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞替代療法可以緩解上述問題，為臨床提供新的思路和治療方式。

多能干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell， ESC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell， iPSC），均具有無限自我更新和分化為三個胚層、各種細(xì)胞類型的能力。ESC來自囊胚內(nèi)表面的細(xì)胞群，安全穩(wěn)定，可以為臨床提供各種所需細(xì)胞類型。iPSC是將體細(xì)胞通過重編程而獲得的多能干細(xì)胞［5-6］，將患者體細(xì)胞重編程后可獲得個體特異的干細(xì)胞，避免了免疫排異反應(yīng)和倫理道德障礙。近年來多個研究通過不同方法從多能干細(xì)胞中誘導(dǎo)分化得到具有一定干細(xì)胞功能的角膜上皮樣細(xì)胞，使其臨床應(yīng)用成為可能。

本文總結(jié)近年來iPSC分化為角質(zhì)細(xì)胞（keratinocyte）、角膜上皮樣細(xì)胞（corneal epitheliumlike cell）的方法和進(jìn)展，探討分化細(xì)胞的純化和鑒定、致瘤性和排斥性、生理功能等問題，并分析臨床應(yīng)用的前景和可能遇到的問題，為科研和臨床中更好地治療此類疾病提供思路。

一、多能干細(xì)胞向角質(zhì)細(xì)胞分化

人們最早關(guān)注多能干細(xì)胞向上皮分化的是皮膚角質(zhì)細(xì)胞，希望通過干細(xì)胞重建皮膚上皮，為皮膚移植提供材料。角膜上皮與皮膚上皮同屬于上皮組織，發(fā)育上都是從外胚層發(fā)育而來，二者在結(jié)構(gòu)、生理特性上有許多相似之處，對誘導(dǎo)分化角質(zhì)細(xì)胞的理解有助于更好地研究角膜上皮樣細(xì)胞的分化。

1. ESC向角質(zhì)細(xì)胞分化：最初，在小鼠ESC的研究中發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4， BMP-4）可誘導(dǎo)上皮分化，BMP信號在胚胎發(fā)育早期外胚層的命運選擇上具有重要作用［7］，而維甲酸（retinoic acid， RA）是細(xì)胞增生和分化的調(diào)節(jié)劑，可抑制細(xì)胞終末分化［8］。據(jù)此，Metallo等報道了一種利用BMP-4和RA等小分子誘導(dǎo)人ESC上皮分化的方法：利用含RA和BMP-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d以誘導(dǎo)分化，再在普通無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果顯示角質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CK14陽性的細(xì)胞比例持續(xù)增加，在大約第30天可達(dá)到35%［9-10］。Guenou等［11］則利用BMP-4和抗壞血酸（ascorbic acid， AA）誘導(dǎo)人ESC分化，并將分化細(xì)胞種植于纖維蛋白基質(zhì)上，移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示分化細(xì)胞表現(xiàn)為基底角質(zhì)細(xì)胞的表型，在移植到小鼠體內(nèi)12周后，可形成與成熟人體皮膚一致的結(jié)構(gòu)。該作者之所以利用AA而不是RA誘導(dǎo)是因為他認(rèn)為AA能夠刺激完全的角質(zhì)細(xì)胞分化，并且他在細(xì)胞培養(yǎng)的全程（約40 d）持續(xù)應(yīng)用AA，更接近胚胎發(fā)育時的上皮形成過程。

2. iPSC向角質(zhì)細(xì)胞分化：iPSC的成功突破為組織再生提供了一種新的多能干細(xì)胞，它具有與ESC同樣的多能性。研究發(fā)現(xiàn)iPSC能夠分化為多種細(xì)胞類型，包括樹突狀細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、運動神經(jīng)元和胰島素生成細(xì)胞等［12］。2011年，兩個研究團隊都利用RA和BMP-4誘導(dǎo)的方法，使iPSC產(chǎn)生具有一定干細(xì)胞特性的角質(zhì)細(xì)胞［13-14］。區(qū)別為一個是依次RA處理3 d、BMP-4處理3 d誘導(dǎo)分化后再培養(yǎng)，而另一個是RA和BMP-4處理2 d后轉(zhuǎn)入含BMP-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。進(jìn)一步將BMP-4誘導(dǎo)產(chǎn)生的表皮祖細(xì)胞種植于明膠中，再移植到裸鼠角膜上，可形成復(fù)層的表皮結(jié)構(gòu)［15］。以大皰性表皮松解癥患者的皮膚成纖維細(xì)胞獲得的iPSC，經(jīng)RA和BMP-4誘導(dǎo)的方法也可產(chǎn)生角質(zhì)細(xì)胞，將角質(zhì)細(xì)胞種植在膠原和成纖維細(xì)胞混合的基質(zhì)上，可形成三維的與皮膚類似的組織，為患者特異性的治療打下基礎(chǔ)［16］。

二、多能干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞分化

角膜結(jié)構(gòu)簡單，具有獨特的免疫赦免機制，是細(xì)胞及器官移植的理想場所，利用多能干細(xì)胞獲得可供移植的眼表組織是研究者一直所期望的。研究者根據(jù)表皮角質(zhì)細(xì)胞分化的經(jīng)驗，進(jìn)一步研究多能干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞的分化策略。

1. ESC向角膜上皮樣細(xì)胞分化：研究發(fā)現(xiàn)，許多組織中干細(xì)胞龕（Niche）在維持干細(xì)胞的特性方面具有重要作用，對于LSC也是如此。LSC與龕的相互作用包括與周圍角膜緣成纖維細(xì)胞的作用，與基底膜中膠原IV的作用，與周圍分泌的細(xì)胞因子的作用等［17-18］。因此，研究者設(shè)想是否可以體外模擬LSC龕的微環(huán)境，誘導(dǎo)ESC向角膜上皮樣細(xì)胞分化。利用膠原IV模擬細(xì)胞外基質(zhì)，利用角膜緣成纖維細(xì)胞或LSC條件化的培養(yǎng)基模擬LSC龕的微環(huán)境，實現(xiàn)了人ESC向角膜上皮樣細(xì)胞的分化［19］。但此方法在誘導(dǎo)小鼠ESC時效果不理想，推測可能與ESC的種屬差異有關(guān)，前述研究以人ESC為對象而該研究以小鼠ESC為對象［20］。利用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化得到的角膜上皮樣細(xì)胞種植在脫細(xì)胞的豬角膜基質(zhì)上后，可形成具有生物功能的組織工程角膜，能夠成功重建損傷的眼表［21］。

根據(jù)RA和BMP-4等小分子化合物誘導(dǎo)ESC向皮膚角質(zhì)細(xì)胞分化的經(jīng)驗，研究者嘗試通過調(diào)整小分子化合物的濃度、作用時間、作用順序等條件，實現(xiàn)了ESC向角膜上皮樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。普遍的方法是先利用RA預(yù)處理ESC 1 ～ 3 d，再利用小分子化合物組合誘導(dǎo)分化，最后在角膜上皮培養(yǎng)基中自發(fā)分化2周到2個月不等的時間得到角膜上皮樣細(xì)胞或形成復(fù)層［22-23］。

Pax6是在眼部發(fā)育中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，特別是在角膜、晶體、神經(jīng)視網(wǎng)膜等結(jié)構(gòu)的形成和功能上具有重要作用［24］，利用Pax6的功能誘導(dǎo)ESC向角膜上皮分化也是一個方向。將帶有綠色熒光蛋白的Pax6 cDNA通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)移到小鼠ESC中，2周后轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞有一半分化為角膜上皮樣細(xì)胞［25］。相反，Pax6基因敲除后，正常的LSC則傾向于向皮膚的角質(zhì)細(xì)胞分化，角膜上皮的修復(fù)能力也下降了，從另一方面證明了Pax6的作用［26-27］。最近發(fā)現(xiàn)ABCB5與Pax6類似，也是角膜上皮發(fā)育和修復(fù)中非常重要的基因，或許能在ESC向角膜上皮的分化中起作用［28］。但基因轉(zhuǎn)染有一定的安全風(fēng)險，目前還不適宜臨床應(yīng)用，因而此方法研究得較少。

2. iPSC向角膜上皮樣細(xì)胞分化：與角質(zhì)細(xì)胞分化研究一樣，iPSC成功突破后，研究者也開始關(guān)注誘導(dǎo)iPSC向角膜上皮樣細(xì)胞分化。依然根據(jù)角膜緣微環(huán)境能夠調(diào)控干細(xì)胞生理特性的原理，將小鼠iPSC培養(yǎng)于膠原IV包被的培養(yǎng)板中，通過Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與分離的角膜緣成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，實現(xiàn)了iPSC向角膜上皮樣細(xì)胞的分化［29］。如果iPSC經(jīng)過BMP-4提前預(yù)處理，分化效果可能更好［30］。研究發(fā)現(xiàn)，iPSC有向其來源組織分化的傾向，例如，通過角膜緣上皮細(xì)胞獲得的iPSC比通過皮膚成纖維細(xì)胞獲得的iPSC更易分化為角膜上皮樣細(xì)胞，分析顯示二者在甲基化區(qū)域上略有差別，可能與二者分化傾向不同有關(guān)［31］。而結(jié)膜上皮細(xì)胞因為內(nèi)源性表達(dá)SOX2和OCT4因子，比結(jié)膜基質(zhì)細(xì)胞更容易轉(zhuǎn)分化為iPSC，并且這種細(xì)胞類型在視網(wǎng)膜色素上皮的分化中更有優(yōu)勢，為iPSC在眼科的應(yīng)用提供新選擇［32］。

三、分化細(xì)胞的純化和鑒定

雖然上述方法可以得到角膜上皮樣細(xì)胞，但最終分化細(xì)胞中還夾雜著未分化的細(xì)胞、分化為其他類型的細(xì)胞等，目前各種誘導(dǎo)方法的分化效率并不很高，這些雜細(xì)胞不僅影響臨床應(yīng)用的療效，也增加了致瘤性、排斥反應(yīng)等風(fēng)險。因此，如何增加細(xì)胞的分化效率、從分化的細(xì)胞中純化角膜上皮樣細(xì)胞還需要深入研究。例如，研究發(fā)現(xiàn)在RA誘導(dǎo)分化過程中能促進(jìn)β-catenin至細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運并下調(diào)Wnt信號通路，因此通過人為抑制Wnt信號通路，能夠促進(jìn)iPSC向角質(zhì)細(xì)胞的分化并提高分化效率［33］。由于終末分化的角膜上皮細(xì)胞中高表達(dá)階段特異性胚胎表面抗原4（SSEA4），而LSC中SSEA4陰性的細(xì)胞較多，因此可利用磁床以SSEA4為陰性標(biāo)記物實現(xiàn)對分化細(xì)胞的純化［34］。也有研究者通過分化細(xì)胞中不同類型細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)黏附性不同的特點來分選細(xì)胞，以獲得純度較高的角膜上皮樣細(xì)胞。

同時，目前缺乏一種角膜上皮樣細(xì)胞或LSC有效而特異的理想標(biāo)記物，對于分化的角膜上皮樣細(xì)胞的鑒定，只能依靠一系列細(xì)胞陽性、陰性標(biāo)記物的組合［35］，因此尋找LSC的特異性標(biāo)志物也是迫切需要解決的問題。Oct4、Nanog、SSEA1等為多能性干細(xì)胞的標(biāo)記物，其在多能性干細(xì)胞中高表達(dá)而在分化的細(xì)胞中低表達(dá)，這些標(biāo)記物陰性表達(dá)表明細(xì)胞已經(jīng)分化較完全［36］。CK15和ABCG2表達(dá)于角膜緣基底部和球結(jié)膜，被認(rèn)為是相對特異的LSC標(biāo)記物［37］。轉(zhuǎn)錄因子p63對于干細(xì)胞的增殖能力起重要作用，在皮膚和角膜緣上皮的基底部均高表達(dá)，但其亞型ΔNp63α則對于LSC具有較好的特異性［38］。CK3/12為角膜上皮細(xì)胞的特異標(biāo)記物，而CK14為皮膚角質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)記物，用此可區(qū)分分化細(xì)胞是接近角膜上皮還是皮膚上皮［39-40］。

四、分化細(xì)胞的安全性

通過體外培養(yǎng)、分化而得到的細(xì)胞在應(yīng)用于臨床前，必須保證其安全性，這里主要指其致瘤性和排斥性，如何鑒定和保證分化細(xì)胞無致瘤性和低排斥性是其臨床應(yīng)用前的關(guān)鍵。ESC或iPSC因為自我更新和分化為各類細(xì)胞的特性，能夠在體內(nèi)自發(fā)形成含有多種組織成分的畸胎瘤甚至惡性程度極高的畸胎癌。目前，減少致瘤性的方法主要是應(yīng)用多能干細(xì)胞來源的分化細(xì)胞，清除分化細(xì)胞中殘存的多能干細(xì)胞，分化程度越高，多能干細(xì)胞來源細(xì)胞的致瘤性越低。但多能干細(xì)胞來源的角膜上皮樣細(xì)胞必須具有一定的干細(xì)胞特性，使其移植后能夠在體內(nèi)持續(xù)增殖，而只要具有干細(xì)胞性，就很難完全消除其致瘤性［41］。目前的分化方法也不能保證分化細(xì)胞中完全不含有多能干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)即使單個多能干細(xì)胞植入體內(nèi)也能夠形成腫瘤［42］。WHO的TRS 878指南是關(guān)于細(xì)胞致瘤性研究的唯一一份國際指南［43］，但因為從多能干細(xì)胞中分化得到的細(xì)胞不在該指南的適用范圍內(nèi)，因此對于分化細(xì)胞確切的致瘤性僅能參考而無法確切評估。

ESC最初被認(rèn)為具有免疫赦免特性，能夠逃避免疫監(jiān)視和攻擊，因為研究發(fā)現(xiàn)ESC低表達(dá)MHCⅠ類、Ⅱ類分子和共刺激分子［44］，同時ESC具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能［45-46］，如抑制T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡，募集Treg細(xì)胞等。雖然隨著ESC分化程度增加其MHCⅠ類、Ⅱ類分子的表達(dá)增加，但仍低于正常成體細(xì)胞的水平。這并不意味著可以忽視多能干細(xì)胞分化細(xì)胞的排斥風(fēng)險，因為在炎癥環(huán)境的刺激下其MHCⅠ類分子的表達(dá)迅速增高［44］，次要組織相容性抗原也在分化細(xì)胞的排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［47］。在分化培養(yǎng)過程中動物產(chǎn)品或非生理成分的應(yīng)用以及長時間培養(yǎng)本身都可能增加細(xì)胞的抗原性［48］。因此，正確評價分化細(xì)胞的排斥性、制定適合的臨床抗排斥治療方案也是其應(yīng)用于臨床前必須做的工作。

五、分化細(xì)胞的生理功能

目前，雖然多種方法可以從ESC或iPSC中獲得角膜上皮樣細(xì)胞，但這些細(xì)胞僅僅是通過一些標(biāo)志蛋白如CK3/12、Integrin、E-cadherin以及短期動物實驗來檢測其是否具有角膜上皮細(xì)胞的功能，未見分化細(xì)胞用于人體或靈長類動物的報道，因此分化細(xì)胞具有怎樣的生理功能、能夠滿足臨床移植的需要仍有待研究。原本認(rèn)為體外培養(yǎng)的LSC或口腔黏膜細(xì)胞移植后發(fā)揮作用主要是替代角膜上皮，但研究發(fā)現(xiàn)缺乏供體細(xì)胞長期存在的證據(jù)，推測其一部分作用可能是促進(jìn)眼表其他部位殘存的上皮干細(xì)胞的活性，使受體原有角膜上皮得以恢復(fù)［49-50］。若從多能干細(xì)胞中分化的角膜上皮樣細(xì)胞移植后有效，那么其發(fā)揮替代作用還是營養(yǎng)作用的就需要明確，這將直接影響臨床手術(shù)方式和術(shù)后治療管理的選擇。研究發(fā)現(xiàn)，LSC不僅能產(chǎn)生角膜上皮發(fā)揮屏障功能，也能夠分泌一些抗血管生成因子，具有抗炎和抑制角膜新生血管的作用，是生理情況下維持角膜無血管化的重要機制，也是治療LSCD的關(guān)鍵作用之一［51］。體外培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞移植雖然也取得了一定的臨床療效，但其抗新生血管的作用就明顯弱于體外培養(yǎng)的LSC［52］，由多能干細(xì)胞分化的角膜上皮樣細(xì)胞的抗新生血管作用如何，目前并未得到系統(tǒng)的研究，這也是關(guān)系到其臨床療效的主要問題。

六、臨床應(yīng)用中需要解決的問題

干細(xì)胞基礎(chǔ)研究方面取得的成果為其臨床應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)，但在實際應(yīng)用過程中，還有許多臨床問題有待解決。首先是要確定什么樣的細(xì)胞可用于臨床治療，無論從ESC還是iPSC分化得到的細(xì)胞，要滿足一定的標(biāo)準(zhǔn)才能保證其安全性和有效性，但目前這一檢測標(biāo)準(zhǔn)還未能提出。其次，由多能干細(xì)胞分化得到的角膜上皮樣細(xì)胞應(yīng)用的臨床適應(yīng)證、療效評價、移植術(shù)前術(shù)后患者的治療及管理、并發(fā)癥的處理等問題，都還缺乏有效的共識，需要將來在臨床應(yīng)用中逐漸摸索。再次，干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定需要嚴(yán)格無菌的環(huán)境、專業(yè)的技術(shù)人員，多數(shù)醫(yī)院無法達(dá)到此要求，建立幾個覆蓋全國的干細(xì)胞中心進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的干細(xì)胞培養(yǎng)和分化能解決此問題，但需要探索干細(xì)胞在儲存、運輸過程中如何保證其原有的生理特性。

七、總結(jié)

利用多能干細(xì)胞來源的角膜上皮樣細(xì)胞治療眼表損傷及相關(guān)疾病，將有效解決臨床移植供體材料短缺的問題。看到在這一領(lǐng)域已經(jīng)取得巨大進(jìn)展，甚至有少量臨床前期和相關(guān)研究的嘗試，但也應(yīng)注意到在真正應(yīng)用于臨床前仍有上述許多問題需要解決。由于角膜相對結(jié)構(gòu)簡單、位置表淺、不易發(fā)生排斥反應(yīng)、易于移植手術(shù)操作等特點，使其有希望成為首批干細(xì)胞治療的應(yīng)用領(lǐng)域，不僅為無數(shù)眼表疾病患者帶來光明的希望，也將成為再生醫(yī)學(xué)重要的里程碑。

1 Whitcher JP， Srinivasan M， Upadhyay MP. Corneal blindness-a global perspective［J］. Bull World Health Organ，2001， 79（3）：214-221.

2 Gatinel D， Hoang-Xuan T. Limbal stem cell defi ciency［J］. J Fr Ophthalmol， 2000， 23（7）：718-728.

3 林志榮， 劉祖國. 角膜緣干細(xì)胞功能障礙的治療進(jìn)展［J/CD］. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版， 2012，2（2）：122-127.

4 周慶軍， 謝立信. 組織工程角膜的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用現(xiàn)狀［J/CD］. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版， 2014，4（1）：1-4.

5 Wernig M， Meissner A， Foreman R， et al. In vitro reprogramming of fi broblasts into a pluripotent ES-cell-like state［J］. Nature， 2007， 448（7151）：318-324.

6 Yu J， Vodyanik MA， Smuga-Otto K， et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］. Science， 2007， 318（5858）：1917-1920.

7 Gambaro K， Aberdam E， Virolle T， et al. BMP-4 induces a Smad-dependent apoptotic cell death of mouse embryonic stem cell-derived neural precursors［J］. Cell Death Differ，2006， 13（7）：1075-1087.

8 Wichterle H， Lieberam I， Porter JA， et al. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons［J］. Cell， 2002， 110（3）：385-397.

9 Metallo CM， Ji L， de Pablo JJ， et al. Retinoic acid and bone morphogenetic protein signaling synergize to efficiently direct epithelial differentiation of human embryonic stemcells［J］. Stem Cells， 2008， 26（2）：372-380.

10 Metallo CM， Ji L， de Pablo JJ， et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells to epidermal progenitors［J］. Methods Mol Biol， 2010， 585：83-92.

11 Guenou H， Nissan X， Larcher F， et al. Human embryonic stem-cell derivatives for full reconstruction of the pluristratified epidermis： a preclinical study［J］. Lancet，2009， 374（9703）：1745-1753.

12 Inoue H， Nagata N， Kurokawa H， et al. iPS cells： a game changer for future medicine［J］. EMBO J， 2014，33（5）：409-417.

13 Bilousova G， Chen J， Roop DR. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into a multipotent keratinocyte lineage［J］. J Invest Dermatol， 2011， 131（4）：857-864.

14 Kogut I， Roop DR， Bilousova G. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into a keratinocyte lineage［J］. Methods Mol Biol， 2014， 1195： 1-12.

15 Yoshida S， Yasuda M， Miyashita H， et al. Generation of stratifi ed squamous epithelial progenitor cells from mouse induced pluripotent stem cells［J］. PLoS One， 2011， 6（12）：e28856.

16 Itoh M， Kiuru M， Cairo MS， et al. Generation of keratinocytes from normal and recessive dystrophic epidermolysis bullosa-induced pluripotent stem cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2011， 108（21）： 8797-8802.

17 Notara M， Shortt AJ， Galatowicz G， et al. IL6 and the human limbal stem cell niche： a mediator of epithelialstromal interaction［J］. Stem Cell Res， 2010， 5（3）：188-200.

18 Tsai RJ， Tsai RY. From stem cell niche environments to engineering of corneal epithelium tissue［J］. Jpn J Ophthalmol， 2014， 58（2）：111-119.

19 Ahmad S， Stewart R， Yung S， et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche［J］. Stem Cells， 2007， 25（5）：1145-1155.

20 Notara M， Hernandez D， Mason C， et al. Characterization of the phenotype and functionality of corneal epithelial cells derived from mouse embryonic stem cells［J］. Regen Med， 2012， 7（2）：167-178.

21 Zhu J， Zhang K， Sun Y， et al. Reconstruction of functional ocular surface by acellular porcine cornea matrix scaffold and limbal stem cells derived from human embryonic stem cells［J］. Tissue Eng Part A， 2013， 19（21-22）：2412-2425.

22 Mikhailova A， Ilmarinen T， Uusitalo H， et al. Smallmolecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells［J］. Stem Cell Reports， 2014， 2（2）：219-231.

23 Kurek D， Neagu A， Tastemel M， et al. Endogenous WNT signals mediate BMP-induced and spontaneous differentiation of epiblast stem cells and human embryonic stem cells［J］. Stem Cell Reports， 2015， 4（1）：114-128.

24 Quiring R， Walldolf U， Kloter U， et al. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans［J］. Science， 1994，265（5173）：785-789.

25 Ueno H， Kurokawa MS， Kayama M， et al. Experimental transplantation of corneal epithelium-like cells induced by Pax6 gene transfection of mouse embryonic stem cells［J］. Cornea， 2007， 26（10）：1220-1227.

26 Li G， Xu F， Zhu J， et al. Transcription Factor PAX6 （Paired Box 6） Controls Limbal Stem Cell Lineage in Development and Disease［J］. J Biol Chem， 2015， 290（33）：20448-20454.

27 Ouyang H， Xue Y， Lin Y， et al. WNT7A and PAX6 defi ne corneal epithelium homeostasis and pathogenesis［J］. Nature， 2014， 511（7509）：358-361.

28 Ksander BR， Kolovou PE， Wilson BJ， et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair［J］. Nature， 2014， 511（7509）：353-357.

29 Yu D， Chen M， Sun X， et al. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells［J］. Cell Biol Int， 2013， 37（1）：87-94.

30 Shalom-Feuerstein R， Serror L， De La ForestDivonne S， et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specifi cation［J］. Stem Cells， 2012， 30（5）：898-909.

31 Hayashi R， Ishikawa Y， Ito M， et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fi broblast and corneal limbal epithelium［J］. PLoS One， 2012， 7（9）：e45435.

32 Poon MW， He J， Fang X， et al. Human ocular epithelial cells endogenously expressing SOX2 and OCT4 yield high efficiency of pluripotency reprogramming［J］. PLoS One，2015， 10（7）：e0131288.

33 Lian X， Selekman J， Bao X， et al. A small molecule inhibitor of SRC family kinases promotes simple epithelial differentiation of human pluripotent stem cells［J］. PLoS One， 2013， 8（3）：e60016.

34 Truong TT， Huynh K， Nakatsu MN， et al. SSEA4 is a potential negative marker for the enrichment of human corneal epithelial stem progenitor cells［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2011， 52（9）：6315-6320.

35 Chee KY， Kicic A， Wiffen SJ. Limbal stem cells： the search for a marker［J］. Clin Experiment Ophthalmol， 2006，34（1）：64-73.

36 Pan GJ， Chang ZY， Sch?ler HR， et al. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4［J］. Cell Res，2002， 12（5-6）：321-329.

37 Lyngholm M， Vorum H， Nielsen K， et al. Differences in the protein expression in limbal versus central human corneal epithelium-a search for stem cell markers［J］. Exp Eye Res，2008， 87（2）：96-105.

38 Di Iorio E， Barbaro V， Ruzza A， et al. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2005， 102（27）：9523-9528.

39 Kurpakus MA， Stock EL， Jones JC. Expression of the 55-kD/64-kD corneal keratins in ocular surface epithelium［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1990，31（3）：448-456.

40 Moll R， Franke WW， Schiller DL， et al. The catalog of human cytokeratins： Patterns of expression in normal epithelia， tumors and cultured cells［J］. Cell， 1982，31（1）：11-24.

41 Blum B， Benvenisty N. The tumorigenicity of human embryonic stem cells［J］. Adv Cancer Res， 2008， 100：133-158.

42 Lawrenz B， Schiller H， Willbold E， et al. Highly sensitive biosafety model for stem-cell-derived grafts［J］. Cytotherapy， 2004， 6（3）：212-222.

43 World Health Organization. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks. Replacement of Annex 1 of WHO Technical Report Series， No. 878［S］. World Health Organ Tech Rep Ser 2013， （978）： 1-384.

44 Drukker M， Katz G， Urbach A， et al. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99（15）：9864-9869.

45 Koch CA， Geraldes P， Platt JL. Immunosuppression by embryonic stem cells［J］. Stem Cells， 2008， 26（1）：89-98.

46 English K， Wood KJ. Immunogenicity of embryonic stem cell-derived progenitors after transplantation［J］. Curr Opin Organ Transplant， 2011， 16（1）：90-95.

47 Robertson NJ， Brook FA， Gardner RL， et al. Embryonic stem cell-derived tissues are immunogenic but their inherent immune privilege promotes the induction of tolerance［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104（52）：20920-20925.

48 Tang C， Drukker M. Potential barriers to therapeutics utilizing pluripotent cell derivatives： intrinsic immunogenicity of in vitro maintained and matured populations［J］. Semin Immunopathol， 2011， 33（6）：563-572.

49 Cauchi PA， Ang GS， Azuara-Blanco A， et al. A systematic literature review of surgical interventions for limbal stem cell deficiency in humans［J］. Am J Ophthalmol， 2008，146（2）：251-259.

50 Pellegrini G， Rama P， Di Rocco A， et al. Concise review：hurdles in a successful example of limbal stem cell-based regenerative medicine［J］. Stem Cells， 2014， 32（1）：26-34.

51 Ma DH， Tsai RJ， Chu WK， et al. Inhibition of vascular endothelial cell morphogenesis incultures by limbal epithelial cells［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1999，40（8）：1822-1828.

52 Kanayama S， Nishida K， Yamato M， et al. Analysis of soluble vascular endothelial growth factor receptor-1 secreted from cultured corneal and oral mucosal epithelial cell sheets in vitro［J］. Br J Ophthalmol， 2009，93（2）：263-267.

Research progress on differentiating pluripotent stem cells into corneal epithelium

WangZhenyu1，2， Zhou Qingjun2， Shi Weiyun2. 1The Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China；2Shandong Eye Institute， Shandong Academy of Medical Sciences， Qingdao 266071， China
Correspondence author： Shi Weiyun， Email： weiyunshi@163.com

Many patients suffer visual impairments because of ocular surface diseases. The cornea or limbal stem cells transplantation is the main treatment for these people， but the treatment is limited by the shortage of donor cells. Due to the great progresses in the research of pluripotent stem cell differentiation， corneal epithelium derived from pluripotent stem cells becomes a solution to this issue. In this review， we summarize recent advances in the enrichment and purification of differentiated cells， and discuss the problem of tumorigenicity， immunological rejection and clinical uses.

Stem cell； epithelium，corneal； cell differentiation；transplantation； limbus corneae

2015-06-08）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.009

973國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2013CB967004）

266071，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院1；266071 青島，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省眼科研究所2

史偉云，Email：weiyunshi@163.com