崔守斌，姜英，武昕

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽110001；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東煙臺(tái)264100）

絲切蛋白1及前纖維蛋白1在外陰鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

崔守斌1，2，姜英1，武昕1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽110001；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東煙臺(tái)264100）

目的 探究絲切蛋白1（CFL1）及前纖維蛋白1（PFN1）在外陰鱗狀細(xì)胞癌（VSCC）中的表達(dá)與意義。方法采用免疫組化和免疫印跡方法檢測(cè)CFL1及PFN1在VSCC中的表達(dá)及其與臨床病理資料相關(guān)性。結(jié)果CFL1在VSCC中的表達(dá)顯著高于外陰的正常皮膚（P＜0.05）；臨床Ⅲ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；在低分化、中分化的VSCC中的表達(dá)明顯高于高分化VSCC（P＜0.05）；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。PFN1在VSCC中的表達(dá)顯著高于外陰的正常皮膚（P＜0.05）；臨床Ⅲ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05）；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）；VSCC低、中分化和高分化之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表達(dá)呈正相關(guān)（r2= 0.753，P＜0.001）。結(jié)論CFL1及PFN1的表達(dá)與VSCC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

絲切蛋白1；前纖維蛋白1；外陰鱗狀細(xì)胞癌；免疫組化；免疫印跡

外陰惡性腫瘤約90%以上為外陰鱗狀細(xì)胞癌（vulvar squamous cell carcinoma，VSCC），常見于60歲以上的絕經(jīng)后婦女，其5年生存率為58.9%～68.9%，目前病因尚不十分清楚。

絲切蛋白1（cofilin-l，CFL1）作為絲切蛋白的2個(gè)亞型之一，是一種分子量約為21 kDa的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（actin binding protein，ABP），基因存在于染色體11q13上，正常表達(dá)于真核生物多種非肌肉組織，尤其是腦和肝中高表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方面起重要作用［1］，目前研究發(fā)現(xiàn)CFL1在肺癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌［2］中呈高表達(dá)，與腫瘤的生長(zhǎng)、遷移、侵襲密切相關(guān)［3］。前纖維蛋白1（profilin-1，PFN1）也被稱為細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合蛋白1，也是ABP的一種，作為前纖維蛋白家族的一個(gè)成員，分子量約為12～15 kDa，基因定位于17p13.3，于真核生物細(xì)胞中普遍存在，參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架重塑，細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)、分裂以及其配體依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能［4］。研究發(fā)現(xiàn)PFN1在一些癌中低表達(dá)，如乳腺癌、胰腺癌［5］、膀胱癌［6］、鼻咽癌、肝癌等，在另一些癌中高表達(dá)，如胃癌、腎癌［7］等。CFL1及PFN1在VSCC中表達(dá)如何，與VSCC發(fā)生發(fā)展是否有關(guān)尚不清楚。因此，本研究通過免疫組化法（SP法）和Western blot方法檢測(cè)CFL1及PFN1在VSCC中的表達(dá)情況，探討其與VSCC的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：選自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2003年6月至2013年6月35例住院VSCC患者；外陰整形手術(shù)中去除正常外陰皮膚組織的20例患者，選取的組織用10%的甲醛固定，制成石蠟塊。搜集VSCC患者的臨床病理資料：年齡32～75歲，平均年齡（55.9±3.6）歲。根據(jù)1988 FIGO臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；分化程度：高分化19例，中分化10例，低分化6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：小鼠抗人Cofilin-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，兔抗人單克隆Profilin-1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）購(gòu)自北京中山金橋公司，ECL試劑盒和BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法檢測(cè)CFL1及PFN1蛋白的表達(dá)：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化。3%H2O2常溫下孵育20 min，使內(nèi)源性過氧化物酶滅活，后行抗原修復(fù)，常溫下羊血清孵育30 min，Cofilin-1（1∶100）及Profilin-1（1∶400）于4℃冰箱過夜，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG室溫孵育15 min，室溫下S-A/HRP中孵育15 min，后DAB顯色劑顯色，最后蘇木素復(fù)染封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照片。結(jié)果判定：CFL1及PFN1均為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)著色，陽性染色為黃色或棕黃色顆粒。使用生物圖片處理系統(tǒng)Meta Morph進(jìn)行平均光密度值測(cè)算。每張切片平均光密度值的測(cè)算，選擇高倍鏡下5個(gè)不同視覺區(qū)域，每個(gè)區(qū)域包括正常皮膚的表皮和部分真皮、癌組織的癌巢與間質(zhì)，然后計(jì)算同一張切片的平均光密度值。

1.2.2 免疫印跡方法：取VSCC組織（10例）和正常外陰皮膚組織（10例），裂解液提取組織總蛋白，制好電泳凝膠后行SDS-PAGE電泳，蛋白電泳轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，其用5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗［CFL1（1∶100）；PFN1（1∶400）；β-actin（1∶1 000）］4℃過夜，次日加二抗［山羊抗兔（1∶5 000）；山羊抗小鼠（1∶5 000）］，常溫孵育2 h，ECL試劑盒顯影。用β-actin作為內(nèi)參照物。用Quantity One軟件半定量分析特異性條帶的灰度值，與內(nèi)參照的灰度值的比較值作為蛋白的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CFL1在VSCC和外陰正常皮膚組織中的表達(dá)

CFL1陽性細(xì)胞表達(dá)于外陰正常表皮細(xì)胞全層，散在分布，呈細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核陽性（圖1A），陽性細(xì)胞的平均光密度值0.284 9±0.011 6；VSCC癌巢細(xì)胞中有陽性表達(dá)，其間質(zhì)中也有表達(dá)（圖1B），陽性細(xì)胞的平均光密度值是0.341 0±0.012 0，2者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.041）。

2.2 Profilin-1在VSCC和外陰正常皮膚組織中的表達(dá)

Profilin-1陽性細(xì)胞表達(dá)于外陰正常表皮近基底層和基底層，呈細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核陽性（圖2A），陽性細(xì)胞的平均光密度值0.150 6±0.008 9，VSCC癌巢細(xì)胞中有陽性表達(dá)，其間質(zhì)中也有表達(dá)（圖2B），陽性細(xì)胞的平均光密度值是0.259 1±0.020 3，2者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.028）。

2.3 CFL1與PFN1表達(dá)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明：CFL1及PFN1在VSCC中的表達(dá)呈正相關(guān)（r2=0.753，P＜0.001），見圖3。

2.4 Western blot法檢測(cè)CFL1與PFN1的表達(dá)

正常外陰皮膚中CFL1的平均灰度值比值（0.33±0.09）低于VSCC（0.99±0.03），2者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。正常外陰皮膚中PFN1的平均灰度值比值（0.88±0.14）低于VSCC（1.39±0.16），2者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000），見圖4。

2.5 CFL1及PFN1的表達(dá)與VSCC的臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

2.5.1 CFL1蛋白表達(dá)的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期與Ⅱ期，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中、低分化組高于高分化組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（P＜0.05）；年齡＜45歲與≥45歲患者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.5.2 PFN1蛋白表達(dá)的平均光密度值：VSCCⅢ期高于Ⅰ期與Ⅱ期（P＜0.05）；中、低分化組略高于高分化組，但兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）；年齡＜45歲與≥45歲患者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

3 討論

肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白作為一種調(diào)控肌動(dòng)蛋白組裝和拆卸的蛋白質(zhì)，在肌動(dòng)蛋白聚合與解聚的動(dòng)態(tài)平衡中起了至關(guān)重要作用，它們有保持細(xì)胞形態(tài)、介導(dǎo)細(xì)胞遷移等生物學(xué)功能，且同癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)緊密相關(guān)［8］。近年研究表明腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重組密切相關(guān)。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組裝活躍是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移，誘發(fā)腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素。

CFLl是真核細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白中的一種，可改變肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)，是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)的重要調(diào)節(jié)因子。它的基本功能是連接纖維狀肌動(dòng)蛋白微絲（F-actin），使F-actin解聚，同時(shí)中止單體球狀肌動(dòng)蛋白微絲（G-actin）的匯集，進(jìn)而增進(jìn)了肌動(dòng)蛋白的轉(zhuǎn)變，這種機(jī)制可能和細(xì)胞偽足形成有關(guān)。Ghosh等［3］通過實(shí)驗(yàn)證明激活CFLl能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的片狀偽足生成，且能引導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)的趨勢(shì)，最終促進(jìn)惡性細(xì)胞的遷移和侵襲。Yamaguchi等［9，10］通過實(shí)驗(yàn)用siRNA沉默CFL1基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞中CFLl表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞偽足的裝配和穩(wěn)定性，最終阻止細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和腫瘤的侵襲。Yap等［11］研究表明在人腦膠質(zhì)瘤的研究中CFLl水平和運(yùn)動(dòng)速率之間存在正相關(guān)，適量增加CFLl表達(dá)可以增加細(xì)胞的移行速度，而抑制CFLl的表達(dá)可降低癌細(xì)胞的遷移速率及侵襲性。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)CFNl的過表達(dá)以濃度依賴的方式促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致了腫瘤的侵襲，這些都提示CFNl的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。關(guān)于CFLl的活性調(diào)節(jié)，Polachini等發(fā)現(xiàn)CFLl活性主要受磷酸化/去磷酸化因素的調(diào)節(jié)，由于CFNl N末端絲氨酸-3（serine-3，Ser-3）位點(diǎn)的磷酸化，導(dǎo)致CFLl滅活，進(jìn)而抑制其F-actin的解聚功能，當(dāng)這一位點(diǎn)再次去磷酸化后又可使CFLl對(duì)F-actin的解聚活性復(fù)活，此兩種形式的交替協(xié)調(diào)控制肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚，從而影響細(xì)胞的遷移，細(xì)胞收縮等［12，13］。目前這種現(xiàn)象在口腔癌及卵巢癌中均已發(fā)現(xiàn)，Polachini等［13］研究證實(shí)CFLl的表達(dá)下調(diào)抑制口腔癌細(xì)胞侵襲。Zhou等［14］研究證實(shí)CFLl的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)展。在VSCC中，我們的研究發(fā)現(xiàn)CFNl高表達(dá)，且隨著細(xì)胞分化程度降低、臨床分期增高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CFLl表達(dá)增加，進(jìn)一步提示CFLl在VSCC中促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，與VSCC的惡性進(jìn)展呈正相關(guān)。

PFN1作為細(xì)胞微絲蛋白調(diào)節(jié)因子，在保持單體微絲蛋白和纖維狀微絲之間動(dòng)態(tài)平衡上發(fā)揮關(guān)鍵作用，它通過結(jié)合肌動(dòng)蛋白，調(diào)整細(xì)胞骨架的重構(gòu)，引發(fā)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。此外于細(xì)胞增殖和凋亡的過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用［15］。目前發(fā)現(xiàn)PFN1在一些腫瘤中低表達(dá)，如乳腺癌、胰腺癌。Zou等［16，17］研究表明PFN1可抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制為PFN1表達(dá)可上調(diào)PTEN基因，從而抑制AKT通路，繼而引起p27蛋白增加，然后p27和cyclin E/ Cdk2復(fù)合體相連結(jié)使細(xì)胞周期停滯在G1期，最終抑制細(xì)胞增殖。Yao等［5］研究證實(shí)在胰腺癌細(xì)胞中，PFN1通過SIRT3-HIF1α機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此認(rèn)為PFN1可能是一個(gè)腫瘤抑制因子。但PFN1在另一些腫瘤中高表達(dá)，Zou等［16］在乳腺癌細(xì)胞系中研究發(fā)現(xiàn)PFN1的過表達(dá)可誘導(dǎo)MDA-MB-231的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機(jī)制是PFN1和肌動(dòng)蛋白之間的相互作用誘導(dǎo)單體微絲蛋白和纖維狀微絲之間失衡，進(jìn)而影響肌動(dòng)蛋白聚合；同時(shí)PFN1的過表達(dá)也增加了R-鈣黏蛋白的表達(dá)，R-鈣黏蛋白也可促進(jìn)MDA -231細(xì)胞向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲［7］。我們的研究顯示PFN1在VSCC中高表達(dá)，且隨著臨床分期增高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PFN1表達(dá)增加，而與細(xì)胞分化程度無關(guān)，進(jìn)一步提示PFN1在VSCC中可能具有促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，增加腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力，而在細(xì)胞分化、增殖方面未起作用。

［1］Pfaendtner J，De L，Voth G.Actin filament remodeling by actin depolymerization factor/Cofilin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（16）：239-254.

［2］Nishimura S，Tsuda H，Kataoka F，et al.Overexpression of cofilin-1 can predict progression-free survival in patients with epithelial ovarian cancer receiving standard therapy［J］.Human Pathol，2011，42（4）：516-521.

［3］Ghosh M，Song X，Mouneimne G，et al.Cofilin promotes actin polymerization and defines the direction of cell motility［J］.Science，2004，304（5671）：743-746.

［4］Witke W.The role of profilin complexes in cell motility and other cellular processes［J］.Trends Cell Biol，2004，14（8）：461-469.

［5］Yao W，Ji S，Qin Y，et al.Profilin-1 suppresses tumorigenicity in pancreatic cancer through regulation of the SIRT3-HIF1α axis［J］. Mol Cancer，2014，13：187-199.

［6］Zoidakis J，Makridakis M，Zerefos P，et al.Profilin 1 is a potential biomarker for bladder cancer aggressiveness［J］.Mol Cell Proteomics，2012，11（4）：M111.009449.

［7］Minamida S，Iwamura M，Kodera Y，et al.Profilin 1 overexpression in renal cell carcinoma［J］.Int J Urol，2011，18（1）：63-71.

［8］曲東明，韓梅，溫進(jìn)坤.肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007，29（2）：219-224.

［9］Hotulainen P，Paunola E，Vartiainen M，et al.Actin-depolymerizing factor and cofilin-1 play overlapping roles in promoting rapid F-actin depolymerization in mammalian nonmuscle cells［J］.Mol Biol Cell，2005，16（2）：649-664.

［10］Yamaguchi H，Lorenz M，Kempiak S，et al.Molecular mechanisms of invadopodium formation：the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin［J］.J Cell Biol，2005，168（3）：441-452.

［11］Yap C，Simpson T，Pratt T，et al.The motility of glioblastoma tumour cells is modulated by intracellular cofilin expression in a concentration-dependent manner［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2005，60（3）：153-165.

［12］Vitolo M，Boggs A，Whipple R，et al.Loss of PTEN induces microtentacles through PI3K-independent activation of cofilin［J］.Oncogene，2013，32（17）：2200-2210.

［13］Polachini G，Sobral L，Mercante A，et al.Proteomic approaches identify members of cofilin pathway involved in oral tumorigenesis［J］.PLoS One，2012，7（12）：e50517.

［14］Zhou J，Wang Y，F(xiàn)ei J，et al.Expression of cofilin 1 is positively correlated with the differentiation of human epithelial ovarian cancer［J］.Oncol Lett，2012，4（6）：1187-1190.

［15］Stevenson R，Veltman D，Machesky L，et al.Actin-bundling proteins in cancer progression at a glance［J］.J Cell Sci，2012，125（5）：1073-1079.

［16］Zou L，Ding Z，Roy P.Profilin-1 overexpression inhibits proliferation of MDA-MB-231 breast cancer cells partly through p27kip1 upregulation［J］.J Cell Physiol，2010，223（3）：623-629.

［17］Das T，Bae Y，Wells A，et al.Profilin-1 overexpression upregulates PTEN and suppresses AKT activation in breast cancer cells［J］.J Cell Physiol，2009，218（2）：436-443.

（編輯 武玉欣）

Cofilin-1 and Profilin-1 Expression in Vulvar Squamous Cell Carcinoma and Its Clinical Significance

CUI Shou-bin1，2，JIANG Ying1，WU Xin1
（1.Department of Gynecology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，The Yantai Affiliated Hospital，Binzhou Medical College，Yantai264100，China）

ObjectiveTo investigate the expression of cofilin-1 and profilin-1 in vulvar squamous cell carcinoma（VSCC）and its significance.MethodsImmunohistochemic staining and Western blot were conducted to study the expression of cofilin-1 and profilin-1 in VSCC and its relationship with the clinicopathologic data.ResultsCofilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in those poorly and moderately differentiated VSCC than in those highly differentiated ones（P＜0.05）.Cofilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in VSCC than in normal vulvar skins（P＜0.05）.Profilin-1 expression was significantly higher in the FIGO Ⅲ stage than in the FIGO Ⅰ and Ⅱ stages（P＜0.05）.Profilin-1 expression was obviously higher in patients with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P＜0.05）.Profilin-1 expression had no statistically significant differences between the poorly and moderately differentiated VSCC and the highly differentiated ones（P＞0.05）.The Pearson correlation analysis showed that cofilin-1 and profilin-1 expression was positively correlated in vulva squamous cell carcinoma（r2=0.753，P＜0.001）.ConclusionCofilin-1 and profilin-1 expression associates with the emergence and development of VSCC.

cofilin-1；profilin-1；vulvar squamous cell carcinoma；immunohistochemistry；Western blot

R737.35

A

0258-4646（2015）01-0010-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（30973190）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（F11-264-1-39）

崔守斌（1982-），男，醫(yī)師，碩士.

武昕，E-mail：xinwu.1964@aliyun.com

2014-10-04

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：