姜濤， 鮑靖， 張麗華， 鮑秀芹

實(shí)驗(yàn)論著

早期高壓氧對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦神經(jīng)保護(hù)的效果探討

姜濤， 鮑靖， 張麗華， 鮑秀芹

目的 探討早期高壓氧對(duì)缺血缺氧性腦損傷(HIBD)新生大鼠腦神經(jīng)保護(hù)的效果。方法 將7日齡新生Wistar大鼠120只隨機(jī)分為假手術(shù)組、HIBD組、高壓氧組，每組各40只。將高壓氧組再隨機(jī)分為早期高壓氧亞組和晚期高壓氧亞組，每亞組各20只。對(duì)所有大鼠建立HIBD模型后(假手術(shù)組采用假手術(shù)處理)，早期高壓氧亞組在建模后1 h內(nèi)，晚期高壓氧亞組在建模后48 h實(shí)行高壓氧治療(2 ATA，每次90 min，24 h 1次，連續(xù)治療7 d)。各亞組治療結(jié)束后處死大鼠，假手術(shù)組與HIBD組處死等量大鼠。利用免疫組織化學(xué)法對(duì)大鼠海馬中神經(jīng)巢蛋白(Nestin)的含量進(jìn)行檢測(cè)，利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 假手術(shù)組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量為(10.26±1.37)個(gè)/HP，早期高壓氧亞組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量為(15.82±2.19)個(gè)/HP，晚期高壓氧亞組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量為(32.64±4.83)個(gè)/HP，HIBD組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量為(36.18±4.02)個(gè)/HP。高壓氧組和HIBD組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，晚期高壓氧亞組顯著高于早期高壓氧亞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，晚期高壓氧亞組與HIBD組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4組平均逃逸潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.18，P<0.05)，假手術(shù)組<早期高壓氧組<晚期高壓氧組早期高壓氧組>晚期高壓氧組，而晚期高壓氧組和HIBD組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組搜索速度組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 早期高壓氧對(duì)HIBD腦損傷具有保護(hù)功能，Nestin蛋白可能參與了腦神經(jīng)的修復(fù)過(guò)程，早期高壓氧還對(duì)HIBD引起的遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能障礙有改善作用。

缺血缺氧性腦??； 高壓氧； 腦神經(jīng)； 大鼠，Wistar； 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)

新生兒缺血缺氧性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)是指在圍生期缺氧導(dǎo)致的腦缺血缺氧性損害。高壓氧技術(shù)在最近幾年廣泛被用于治療HIBD，被認(rèn)為是目前比較有效的治療方法。國(guó)外有報(bào)道稱(chēng)高壓氧可以在短時(shí)間內(nèi)提高血液中的氧分壓，改善大腦缺氧狀態(tài)，可以有效、迅速糾正腦缺血缺氧狀態(tài)[1]。但目前高壓氧對(duì)HIBD的作用機(jī)制尚未明了，本次研究擬通過(guò)建立大鼠HIBD模型，探討早期高壓氧對(duì)HIBD新生大鼠腦神經(jīng)保護(hù)的效果，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 7日齡清潔級(jí)Wistar大鼠120只，雄性51只，雌性69只，體質(zhì)量11～13 g，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供(生產(chǎn)許可證：SCXK(吉)-2011-0004)。按隨機(jī)數(shù)字表法將120只大鼠分為假手術(shù)組、HIBD組、高壓氧組，每組各40只。將高壓氧組按隨機(jī)數(shù)字表法分為早期高壓氧亞組和晚期高壓氧亞組，每亞組各20只。

1.2 HIBD模型建立方法 采用經(jīng)典Rice法制作HIBD模型[2]。將大鼠用乙醚麻醉，仰臥位固定，備皮，消毒頸部周?chē)つw，沿正中線(xiàn)作頸部切口，找到并游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，近心端結(jié)扎后剪斷。整個(gè)過(guò)程控制在10 min內(nèi)。術(shù)后2 h將大鼠放入37 ℃恒溫密閉箱內(nèi)，向箱內(nèi)持續(xù)通氮氧混合氣體，控制箱內(nèi)氧濃度為70 mL/L，2 h后將大鼠取出，由母鼠喂養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠只游離左側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合。

1.3 高壓氧操作方法 早期高壓氧亞組大鼠在建模后1 h，晚期高壓氧亞組大鼠在建模后48 h放入氧體積分?jǐn)?shù)900～1 000 mL/L，壓力為2 ATA的氧倉(cāng)內(nèi)吸氧90 min，每間隔24 h進(jìn)行治療1次，連續(xù)治療7次。每日記錄大鼠生存情況。

1.4 神經(jīng)巢(Nestin)蛋白和Morris水迷宮測(cè)定方法 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)，將各亞組大鼠取10只檢測(cè)Nestin蛋白，另外10只進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

用于檢測(cè)Nestin蛋白的大鼠處死后，開(kāi)胸，暴露心臟，行主動(dòng)脈插管，用10 ℃生理鹽水充分沖洗血液。開(kāi)顱取腦后，迅速放入-35 ℃恒冷箱切片機(jī)中保存，2～3 h后沿視交叉做厚10 μm的冠狀冰凍切片，經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理后，放入20 ℃恒溫箱中干燥[3]。用免疫組織化學(xué)SABC法對(duì)切片進(jìn)行染色，單抗選擇1∶100小鼠抗大鼠的Nestin單克隆抗體，DAB染色，Nestin蛋白在胞質(zhì)內(nèi)呈棕色或棕褐色為陽(yáng)性。每個(gè)標(biāo)本觀察3張切片，每張切片在400倍鏡下選取4個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算平均值。

本次實(shí)驗(yàn)用直徑為120 cm的Morris水迷宮，并均分為4個(gè)象限，在其中1個(gè)象限內(nèi)放置一個(gè)略高出水面的平臺(tái)，將該象限設(shè)置為平臺(tái)象限。實(shí)驗(yàn)前24 h將大鼠放入迷宮，自由游泳3 min。測(cè)試內(nèi)容：(1)定位航行。每天上午9時(shí)將每只大鼠從4個(gè)象限入水點(diǎn)放入迷宮，記錄從大鼠進(jìn)入迷宮到四肢完全爬上平臺(tái)所耗時(shí)間，即逃逸潛伏期，連續(xù)測(cè)試4 d。(2)空間探索。第5日將平臺(tái)撤走，將大鼠放入迷宮后，記錄120 s內(nèi)大鼠的行動(dòng)軌跡、對(duì)原平臺(tái)的搜索耗時(shí)和搜索距離，計(jì)算搜索速度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Nestin蛋白檢出情況 見(jiàn)表1。

表1結(jié)果表明，4組大鼠Nestin蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，高壓氧組和HIBD組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；晚期高壓氧亞組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量顯著高于早期高壓氧亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；晚期高壓氧亞組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量與HIBD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果 見(jiàn)表2，3。

表2結(jié)果表明，4組大鼠平均潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，各組大鼠的組內(nèi)平均逃逸潛伏期每天均顯著較前一天縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。前三天，4組平均逃逸潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.18，P<0.05)，假手術(shù)組<早期高壓氧組<晚期高壓氧組0.05)。

表3結(jié)果表明，4組大鼠空間探索各項(xiàng)指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，假手術(shù)組、早期高壓氧組和晚期高壓氧組3組大鼠在搜索耗時(shí)和搜索路程上組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.05，P<0.05)，均為假手術(shù)組>早期高壓氧組>晚期高壓氧組，而晚期高壓氧組與HIBD組在搜索耗時(shí)和搜索路程上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組搜索速度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

高壓氧作為目前一種比較有效的治療方法用于治療新生兒疾病，特別是缺血缺氧性腦病已有多年歷史，但由于缺乏科學(xué)的理論依據(jù)和對(duì)毒副反應(yīng)的誤解，在臨床應(yīng)用中有爭(zhēng)議[4]。目前多數(shù)動(dòng)物研究認(rèn)為高壓氧對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病治療有效，可減輕神經(jīng)元損傷，促進(jìn)遠(yuǎn)期功能的恢復(fù)。Nestin蛋白是一種中間絲蛋白，主要分布在神經(jīng)上皮干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，是細(xì)胞骨架的重要構(gòu)成部分。Hei等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)Nestin蛋白在神經(jīng)上皮干細(xì)胞開(kāi)始遷移時(shí)，其陽(yáng)性表達(dá)開(kāi)始增加，遷移過(guò)程完成后，其含量逐漸下降，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞分化成熟后停止表達(dá)，故Nestin蛋白一直被認(rèn)為是神經(jīng)上皮干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。楊榮等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)，在大鼠建立缺血缺氧模型后，其腦內(nèi)缺血缺氧區(qū)域，以及周?chē)糠謪^(qū)域的Nestin蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著上升。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高壓氧組和HIBD組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，晚期高壓氧亞組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量顯著高于早期高壓氧亞組(P<0.05)，而晚期高壓氧亞組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出數(shù)量略低于HIBD組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這說(shuō)明HIBD后腦部神經(jīng)細(xì)胞迅速再生以代償因缺血缺氧而壞死的細(xì)胞，而早期高壓氧組大鼠腦組織內(nèi)Nestin蛋白雖然較假手術(shù)組表達(dá)顯著升高(P<0.05)，但顯著低于晚期高壓氧組(P<0.05)，這說(shuō)明早期應(yīng)用高壓氧對(duì)HIBD效果顯著。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，高壓氧療法可以迅速提高腦內(nèi)組織的含氧量以及氧儲(chǔ)備量，對(duì)糾正腦組織缺血缺氧狀態(tài)迅速、有效，且可以降低腦細(xì)胞因缺血缺氧而發(fā)生的壞死。而Zhang等[8]研究結(jié)果顯示，高壓氧不僅可以有效降低無(wú)氧酵解過(guò)程，糾正酸中毒狀態(tài)，還對(duì)腦血管有收縮作用，從而減少腦血流量，達(dá)到降低腦水腫的目的。而對(duì)于高壓氧對(duì)HIBD的治療機(jī)制，石瑞成等[9]認(rèn)為是由于高壓氧狀態(tài)可以增加腦內(nèi)超氧化物歧化酶的含量，對(duì)缺氧產(chǎn)生的自由基迅速清除，提高抗氧化能力，從而可以減輕再灌注后引起的缺血-再灌注損傷過(guò)程。本次研究結(jié)果也證實(shí)了石瑞成的觀點(diǎn)。本次研究結(jié)果證明，早期應(yīng)用高壓氧，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞可以起到更好的保護(hù)作用，這可能是因?yàn)樵陂L(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧后，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了不可逆的壞死，需要神經(jīng)干細(xì)胞大量增生、代償，而這個(gè)過(guò)程十分緩慢，晚期高壓氧組中Nestin蛋白的大量表達(dá)也間接證實(shí)了這一點(diǎn)。

Morris水迷宮是測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的有效方法，可以間接反應(yīng)海馬區(qū)的功能[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4組平均逃逸潛伏期為假手術(shù)組<早期高壓氧組<晚期高壓氧組0.05)，這可能是因?yàn)榇舜蔚腍IBD建模還不能對(duì)大鼠的遠(yuǎn)期運(yùn)動(dòng)功能產(chǎn)生影響，而早期高壓氧和晚期高壓氧兩組在搜索速度上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明延遲高壓氧治療無(wú)法對(duì)遠(yuǎn)期的腦運(yùn)動(dòng)功能起到保護(hù)作用，而其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Feldman J, Renda N, Markovitz GH, et al. Treatment of carbon monoxide poisoning with hyperbaric oxygen and therapeutic hypothermia. Undersea Hyperb Med，2013，40(1):71-79.

[2] Wang IC, Liu HT, Yu CM, et al. Effect of hyperbaric oxygenation on intervertebral disc degeneration: an in vivo study with sprague-dawley rats[J].Spine (Phila Pa 1976)，2013，38(3):E137-142.

[3] Li ZK, Zhang Y, Ke H, et al. Dose-effect relationship between androgen and neural protection in neonatal rats with hypoxic-ischemic braindamage and adverse effects of androgen. Zhonghua Erke Zazhi，2011，49(2):151-156.

[4] Wang D, Huang Y, Li Q, et al. Anti-apoptotic effect of ginsenoside Rg1 on neuron after neonatal hypoxia ischemia brain damage[J].Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi,2010,24(9):1107-1112.

[5] Hei M, Luo Y, Zhang X, et al. Tanshinone IIa alleviates the biochemical changes associated with hypoxic ischemic brain damage in a rat model[J].Phytother Res,2011,25(12):1865-1869.

[6] 楊榮,任東,潘誠(chéng)，等.高壓氧治療復(fù)合燒傷大鼠移植皮片的生長(zhǎng)成活:隨機(jī)分組對(duì)照[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(5):899-902.

[7] Wang LL, Guo WJ, Xiong Y, et al. Study on the expression and the role of macrophage migration inhibitory factor in the brain of neonatal rats withhypoxia-ischemia brain damage[J]. Sichuan Daxue Xuebao Yixueban,2011,42(2):199-203.

[8] Zhang Q, Ding Y, Yao Y, et al. Creating rat model for hypoxic brain damage in neonates by oxygen deprivation[J]. PLoS One,2013,8(12):e83589

[9] 石瑞成,馮士軍,王志剛，等.高壓氧聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(19):3507-3512.

[10] Kjelkenes I, Thorsen E. Time course of the reduction in nitric oxide concentration in exhaled gas after exposure to hyperbaric hyperoxia[J]. Diving Hyperb Med,2009,39(2):77-80.

(本文編輯：劉穎)

Study on the effect of early hyperbaric oxygen in protecting brain nerves of neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage

JIANGTao,BAOJing，ZHANGLihua，BAOXiuqin.

JiamusiUniversityThirdAffiliatedHospital，Jiamusi154002，China.

Objective To investigate the effect of early hyperbaric oxygen(HBO) in protecting brain nerves of neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage(HIBD).Methods A total of 120 7-day old neonatal Wistar rats were randomly divided into sham operation group(control group), hypoxic ischemic brain injury group(group HIBD) and hyperbaric oxygen group(HBO group), with 40 rats in each group. The HBO group was randomly divided into early hyperbaric oxygen subgroups(EHBO subgroup) and late hyperbaric oxygen subgroups(LHBO subgroup),with 20 rats in each group. After establishing the HIBD model for all rats(control group with sham operation),hyperbaric oxygen treatment was performed in EHBO subgroup after 1 h, and in LHBO subgroup after 48 h(2 ATA, every 90 minutes, 24 hours once, continuous treatment of 7 day).After treatment, the rats in subgroups were killed, and the same number of rats in the control group and HIBD group were also killed. Hippocampus Nestin in the nerve of rat was determined using immunohistochemical method, and learning and memory function in rats were tested using the Morris water maze test. Results In the control group Nestin positive cell detection rate was (10.26±1.37)/HP, in EHBO subgroup it was (15.82±2.19)/HP, LHBO subgroup (32.64±4.83)/HP, HIBD group (36.18±4.02)/HP. The detection rate of Nestin positive cells in the HBO group, and HIBD group was significantly higher than that of the control group(P<0.05), and in the LHBO subgroup it was significantly higher compared with that of the EHBO subgroups(P<0.05), while the LHBO subgroup and HIBD group had no significant difference(P>0.05); the four groups had significant differences in average EL (F=24.18,P<0.05)；the rats in control group，EHBO and LHBO group had significant difference in the search time and search distance(F=21.05,P<0.05), but there was no significant difference between LHBO and HIBD groups and among the groups in search time(P>0.05). Conclusion Early BHO has protective effect on brain injury；Nestin protein may be involved in the repair of brain nerves；early HBO can improve the future learning and memory function which is impaired by HIBD.

hypoxic ischemic brain damage; hyperbaric oxygen; cranial nerve; Wistar rat; animal,experiment

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目資助(12511537)；佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目資助(sz2014-002)

154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第三醫(yī)院腦癱三科

姜濤(1984-)，男，醫(yī)師，2012級(jí)佳木斯大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院碩士研究生在讀。研究方向：腦損傷的發(fā)病機(jī)制及其早期防治研究。

張麗華，154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第三醫(yī)院腦癱三科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.03.007

R-33

A

1674-3865(2015)03-0215-04

2015-04-10)