黎遠(yuǎn)冬 綜述 匡志鵬 審校

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部

綜述

代謝組學(xué)技術(shù)在篩選肝癌標(biāo)志物中的應(yīng)用

黎遠(yuǎn)冬 綜述 匡志鵬 審校

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部

肝癌的早期診斷是提高患者生存率的一項重要措施。代謝組學(xué)通過對某些代謝產(chǎn)物進(jìn)行“全景式”分析，并與正常人的代謝產(chǎn)物比較，篩查肝癌潛在的生物標(biāo)志物，可能為一種較好的肝癌診斷方法。本文就近年來代謝組學(xué)技術(shù)在篩選肝癌標(biāo)志物中的應(yīng)用作一綜述。

肝腫瘤；代謝組學(xué)；標(biāo)志物；應(yīng)用

肝癌的早期診斷是提高患者生存率的一項重要措施。AF P是目前肝癌診斷應(yīng)用較廣的標(biāo)志物，在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的慢性肝炎、肝硬化中也能夠觀察到AF P濃度升高，血清AF P檢測被認(rèn)為不再是肝癌早期診斷的惟一篩選手段［1，2］，因此篩查合適的肝癌早期診斷標(biāo)志物亟待解決。代謝組學(xué)（met a bo n om i cs）是20世紀(jì)90年代中期繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，是對一個生物系統(tǒng)的細(xì)胞在特定時間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)的定量分析［3，4］，與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)與生理學(xué)的聯(lián)系更加緊密。因為疾病導(dǎo)致機(jī)體病理生理過程的變化，最終引起代謝產(chǎn)物發(fā)生相應(yīng)的改變，通過對某些代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并與正常人的代謝產(chǎn)物比較，尋找疾病的生物標(biāo)志物，將提供一種較好的疾病診斷方法。目前采用代謝組學(xué)方法篩選肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物逐漸成為研究熱點，本文就此作一綜述，以期為尋找理想的肝癌標(biāo)志物提供新的途徑。

1 代謝輪廓分析

臨床上約80%的肝癌患者由肝硬化發(fā)展而來，肝硬化患者的再生結(jié)節(jié)與腫瘤非常相似，此外，慢性肝炎中約20%的患者AF P假陽性，在肝硬化患者中甚至有更高的AF P假陽性存在［5］，因此這兩種人群的肝癌早期診斷比較困難。W an g等［6］采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（u lt r a-h ig h pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h y-t an demm a ssspect r omet r y，UP L C-M S）進(jìn)行血清代謝輪廓分析，從220種血清代謝物中篩選并鑒定出13種可能為肝癌患者主要代謝途徑的重要障礙，其參與肝臟的有機(jī)酸、磷脂、膽汁酸和脂肪酸4個關(guān)鍵代謝通路；UP L C-M S聯(lián)合血清AF P檢查可較好鑒別肝癌患者、肝硬化患者及健康人，其敏感性和特異性均為100%，認(rèn)為該法是在肝硬化高危人群中進(jìn)行肝癌早診的一種有效手段。在以往的研究中，標(biāo)志物在肝硬化、肝癌的改變方向往往是相同的，比如標(biāo)志物上調(diào)或下調(diào)。刀豆氨酸琥珀酸（C SA）是一種有機(jī)酸代謝物，是首次被鑒定在肝硬化組明顯降低而在肝癌組中顯著上調(diào)的代謝物。有趣的是，單獨利用C SA診斷肝癌的靈敏性和特異性分別為79.3%、100%，高于AF P20或AF P200［6］。此外，C SA聯(lián)合AF P20檢查鑒別肝癌與肝硬化的靈敏性、特異性分別為96.4%、100%。認(rèn)為C SA在鑒別肝癌與肝硬化中可能有重要的應(yīng)用價值，建議在肝癌高危人群中利用C SA監(jiān)測進(jìn)行肝癌的早期診斷［6］。Zh o u等［7］采用血清代謝輪廓分析肝癌、慢性肝臟疾病和健康人群血清共同和特異性代謝改變。血清內(nèi)源性大麻素（AEA）和十六基乙醇胺（P EA）的水平在肝癌組中相對于慢性肝臟疾病、健康人群顯著升高。單獨或聯(lián)合應(yīng)用AEA、P EA鑒別慢性肝臟疾病與肝癌顯示出較好的靈敏性和特異性，可作為區(qū)分肝癌、慢性肝臟疾病的潛在標(biāo)志物。進(jìn)一步研究乙肝病毒、丙肝病毒感染的肝癌患者血清代謝特征，發(fā)現(xiàn)兩組病例中有相似的代謝輪廓，研究結(jié)果有助于探索共同的發(fā)病機(jī)制。X i a o等［8］采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（u lt r a-h ig h pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h y-q ua d r u polet i me of fl ig h tm a ss spect r omete r，UP L C-Q T OF M S）技術(shù)分析埃及肝癌、肝硬化人群中血清代謝物，篩選出鑒別肝癌、肝硬化相關(guān)的代謝物，然后通過同位素方法采用超高效液相色譜-三重四極線性離子阱（u lt r a-h ig h pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h y-t ri ple q ua d r u pole l i n e a r i o n t r a p，UP L C-QqQL IT）技術(shù)對篩選出的代謝物及其他肝癌候選標(biāo)志物進(jìn)行定量分析，結(jié)果膽汁酸代謝物甘氨脫氧膽酸、油酰肉毒堿等表達(dá)水平在肝癌、肝硬化人群中有顯著差異，認(rèn)為篩選的代謝物可作為鑒別肝硬化與早期肝癌的候選標(biāo)志物。

2 脂類代謝組學(xué)分析

脂類代謝異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。脂類代謝組學(xué)能揭示與腫瘤相關(guān)的脂類變化，尋找其異常的代謝通路，在尋找用于腫瘤早期診斷的脂類標(biāo)志物方面展現(xiàn)出廣闊的前景。C h e n等［9］利用脂類代謝組學(xué)技術(shù)研究慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者的血清，結(jié)果鑒定出卵磷脂、鞘磷脂、三酰基甘油酯、膽固醇酯等96種脂類代謝物，其中75種脂類代謝物的表達(dá)異常，相對于健康組、肝炎組，在肝硬化組、肝癌組中大多數(shù)脂類代謝物均下調(diào)。認(rèn)為血清脂類代謝物可以反映肝功能狀態(tài)。Pa tte r so n等［10］采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法（u lt r a pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h yelect r osp r a y i o n i za t i o n-q ua d r u pole t i me-of-fl ig h tm a ss spect r omet r y，UP L C-ES I-T Q M S）聯(lián)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（g a s c h r om a to gr a p h y-m a ss spect r omet r y，G C-M S）技術(shù)分析肝癌、肝硬化、急性髓系白血病以及健康人群血清中脂類代謝物，發(fā)現(xiàn)2種結(jié)合膽汁酸、2種膽汁色素在肝癌中上調(diào)，11種lysop h osp h oc h ol i n es（L P C）分子下調(diào)，而二十四烷酸、神經(jīng)酸在肝癌中幾乎不表達(dá)，所有這些脂類分子改變對研究肝癌病理學(xué)提供了新的見解。

3 靶向代謝組學(xué)分析

采用代謝組學(xué)研究在健康和疾病狀態(tài)下生物樣本中所有代謝物的規(guī)律揭示與疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的代謝產(chǎn)物，必然獲得海量的信息，這些信息包含大量干擾潛在標(biāo)志物篩選的外源性代謝物信息，有可能使一些真正有價值的潛在標(biāo)志物缺失。靶向代謝組學(xué)分析是采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證預(yù)先確認(rèn)的代謝物的一種定量分析方法。Ban i a s a d i等［11］以L C-M S/M S為分析平臺，對與重要代謝物通路有關(guān)的73種代謝物進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析，并比較肝癌、丙型肝炎病毒感染的肝硬化病例，結(jié)果16種代謝物在兩組病例中顯著改變，采用最低P值方法進(jìn)一步篩選出蛋氨酸、5-羥基-2-脫氧尿苷、N2，N2-二甲基鳥苷、尿酸4種候選生物標(biāo)志物，聯(lián)合多元統(tǒng)計分析推導(dǎo)出一種精確的診斷模式，該診斷模式能夠很好識別肝硬化與肝癌人群，其靈敏性、特異性分別為97.0%、95.0%，對于了解肝癌高危人群在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中代謝物改變規(guī)律提供一種理想的手段。

4 利用尿液篩選肝癌標(biāo)志物

尿液作為更易獲得的生物樣品，和血清一樣包含大量因疾病而改變的代謝信息，利用代謝組學(xué)方法從尿液中篩選肝癌潛在生物標(biāo)志物已取得快速發(fā)展。S ha ri ff等［12］研究丙型肝炎病毒感染的埃及人群中肝癌、肝硬化及健康組的尿液，鑒定出有鑒別價值的甘氨酸、氧化三甲胺、馬尿酸鹽、檸檬酸鹽、肌酸酐、肌酸和肉毒堿7種代謝物。應(yīng)用偏最小二乘判別分析（P L S-D A）建立的識別模型進(jìn)行診斷，區(qū)分肝癌組與健康組、肝癌組和肝硬化組的敏感性與特異性分別為100%vs 94%和81%vs71%。S ha ri ff等［13］用同樣的方法研究主要由乙型肝炎病毒感染的尼日尼亞人群中肝癌、肝硬化及健康人群的尿液也得到類似結(jié)果，首次在兩種病因、不同人種中得到肝癌尿液相似代謝物的改變，認(rèn)為代謝物改變與腫瘤有關(guān)，而與種族和病因?qū)W無關(guān)。C h e n等［14］聯(lián)合氣相色譜飛行時間質(zhì)譜（g a s c h r om a to gr a p h y t i me-of-fl ig h tm a ss spect r omet r y，G C-T OF M S）和UP L C-Q T OF M S兩個分析平臺對血清、尿液兩種生物樣品不同類型的肝癌、肝血管瘤及健康人群進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定出與膽汁酸、游離脂肪酸、糖酵解、尿素循環(huán)、蛋氨酸等代謝通路有關(guān)的43種血清代謝物及31種尿液代謝物。通過兩個分析平臺、兩種生物樣品對代謝物進(jìn)行交叉驗證，顯示甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、?；悄懰岷往Z去氧膽酸與肝硬化及肝炎有關(guān)，應(yīng)用建立的診斷模式能夠100%鑒別AF P小于20 n g/ml的肝癌與健康人群。研究結(jié)果顯示，建立的代謝組學(xué)診斷方法有可能成為肝癌診斷及分類的有效篩選工具。

5 問題與展望

目前應(yīng)用最廣泛的代謝組學(xué)分析平臺是液質(zhì)聯(lián)用儀（l i q u i d c h r om a to gr a p h y-m a ss spect r omet r y，L C-M S）［15］。由于代謝物豐度、物理、化學(xué)性質(zhì)的差異及離子化期間基體效應(yīng)的離子抑制或放大作用等多因素影響，在實際應(yīng)用中基于L C-M S的技術(shù)平臺進(jìn)行代謝組學(xué)研究的僅僅是一種半定量信息，分析方法有較大局限性和不確定性。

人體中各類內(nèi)源性小分子代謝物有上萬種。盡管各種分析技術(shù)平臺在代謝物及代謝途徑方面的研究已取得快速發(fā)展，但由于生物樣本的復(fù)雜性、多樣性和不穩(wěn)定性以及每個技術(shù)平臺存在的局限性，因此沒有任何一個技術(shù)平臺能夠滿足所有代謝物測量需要，目前代謝組學(xué)研究的只是全部代謝物的少部分［5～14］，我們僅了解5%～10%。如何拓寬代謝組學(xué)檢測的覆蓋范圍，排除外界因素干擾是目前代謝組學(xué)研究需要解決的問題。因此，代謝組學(xué)研究最大的挑戰(zhàn)在于對代謝產(chǎn)物的識別及進(jìn)一步解釋所發(fā)現(xiàn)的代謝物與生物過程或生物狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。

通過添加同位素標(biāo)記的類似物內(nèi)標(biāo)調(diào)整離子基體效應(yīng)和試樣損耗，采用L C/ES I-M S平臺再次對標(biāo)本進(jìn)行靶向代謝輪廓定量分析。靶向代謝輪廓分析可以使代謝物檢測更準(zhǔn)確且范圍向低濃度延伸，因此在增加定量的準(zhǔn)確性的同時也擴(kuò)大了檢測的覆蓋范圍。另外，反相色譜柱與親水色譜柱聯(lián)合作為代謝物的色譜分離柱能彌補(bǔ)單一反相色譜極性代謝物鑒定較少的缺點，拓寬了檢測的覆蓋范圍。

總之，代謝組學(xué)目前尚處在初生階段，我們對這些分子的作用仍然知之甚少。但是，相信隨著其方法的不斷完善和優(yōu)化，代謝組學(xué)研究必將成為人類更高效、準(zhǔn)確地診斷疾病的一種有力手段。

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［2014-10-22收稿］［2014-12-18修回］［編輯 羅惠予］

R735.7

A

1674-5671（2015）04-03

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.16

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研基金資助項目（重2012090）