黃夏冰， 康巧珍， 傅 國， 汲振余， 劉 鑫

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 河南 鄭州 450000；2.河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院 河南 鄭州 45000)

GST-NAP融合蛋白可溶性表達(dá)及柱上切割GST標(biāo)簽

黃夏冰1， 康巧珍1， 傅 國1， 汲振余2， 劉 鑫1

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 河南 鄭州 450000；2.河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院 河南 鄭州 45000)

利用基因工程的方法，以實(shí)驗(yàn)室保存的pMAL-C2X-NAP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增NAP基因, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-NAP.重組質(zhì)粒通過酶切和測序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，再經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)獲得可溶性GST-NAP融合蛋白，最后利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠樹脂進(jìn)行純化，Prescission蛋白酶進(jìn)行柱上切割去除GST標(biāo)簽.結(jié)果表明，pGEX-NAP重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，在大腸桿菌中經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，可獲得大量可溶性GST-NAP融合蛋白.Prescission蛋白酶柱上切割去除GST標(biāo)簽后，經(jīng)Western Blot 驗(yàn)證NAP蛋白能被兔抗NAP多克隆抗體特異識別.

GST-NAP； 重組質(zhì)粒； 蛋白表達(dá)； GST標(biāo)簽

0 引言

HP-NAP是幽門螺桿菌中的一種能趨化并激活中性粒細(xì)胞的可溶性蛋白，它能促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附胃黏膜內(nèi)皮，并且能夠刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基.到目前為止，HP-NAP被證實(shí)是Dps(DNA protection during starvation)家族中唯一能夠激活人類白細(xì)胞的蛋白，和HP-NAP結(jié)構(gòu)相似的Flp、Dlp-1和Dlp-2都沒有此功能.與其他結(jié)構(gòu)相似的分子比較，HP-NAP具有獨(dú)特陽離子電荷簇，這可能有利于炎癥細(xì)胞的激活.已有報(bào)道，HP-NAP具有通過逆轉(zhuǎn)Th1/Th2平衡，抗旋毛蟲感染，抗哮喘及治療腫瘤的潛力[1-8]，同時(shí)也被認(rèn)為是極具潛力的侯選免疫調(diào)節(jié)劑[9].

HP-NAP可從幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)水抽提物中獲得，然而由于H.pylori培養(yǎng)條件較為苛刻，無法進(jìn)行H.pylori的大規(guī)模培養(yǎng)，且體外條件下不同菌株HP-NAP表達(dá)量差異較大，因此，大量HP-NAP的穩(wěn)定獲得受到較大限制[10].目前，利用基因工程的方法重組表達(dá)目的基因，能夠快速簡便得到大量蛋白[11].E.coli作為基因工程菌, 具有生產(chǎn)周期短、成本低、易線性放大等優(yōu)點(diǎn)，且該工程菌質(zhì)粒上攜帶有多種融合標(biāo)簽，有利于目標(biāo)蛋白的表達(dá)純化[12].作為E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)融合標(biāo)簽，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)能夠增加外源蛋白的可溶性[13-16].pGEX系列載體是高效表達(dá)GST的原核表達(dá)載體，其中pGEX-6P-1帶有IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子, 融合蛋白產(chǎn)物帶有GST標(biāo)簽，因此可通過GST層析柱簡便、快速地純化，最終可以通過Prescission蛋白酶切割GST標(biāo)簽快速釋放目的蛋白.

本研究構(gòu)建了HP-NAP的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-NAP, 通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化得到大量的GST-NAP，經(jīng)柱上切割成功去除GST標(biāo)簽，得到的NAP蛋白經(jīng)Western Blot驗(yàn)證可被兔抗NAP多克隆抗體特異識別.本研究為進(jìn)一步研究HP-NAP的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 pMAL-C2X-NAP質(zhì)粒及pGEX-6P-1質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α、BL21(DE3)感受態(tài)購自于鄭州鼎國生物有限公司.

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA marker購自于寶生物工程(大連)有限公司；還原型谷胱甘肽、谷胱甘肽瓊脂糖樹脂購自于上海生工生物工程公司；低相對分子質(zhì)量蛋白marker購自于北京全式金有限公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺等購自于鄭州鼎國生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 pGEX-NAP重組質(zhì)粒的構(gòu)建 首先，以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的pMAL-C2X-NAP質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出HP-NAP基因，擴(kuò)增HP-NAP基因的所用引物為：

F: 5′-GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAATTTTA-3′(含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，

R: 5′-AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTGCAGC-3′(含有SalⅠ酶切位點(diǎn)).

然后將擴(kuò)增得到的HP-NAP片段和空質(zhì)粒載體pGEX-6P-1用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收后用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接.最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，取少量菌液涂布到含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h后挑取單菌落，接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日提取質(zhì)粒.經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切電泳驗(yàn)證，結(jié)果正確的質(zhì)粒送去測序.

1.2.2 GST-NAP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pGEX-NAP轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜.次日挑取單菌落，接種于5 mL LB培養(yǎng)基中(含Amp 100 μg/mL)，37 ℃，200 rpm活化過夜.然后按1%比例接種于500 mL LB培養(yǎng)基中(含Amp 100 μg/mL)，37 ℃，230 rpm擴(kuò)大培養(yǎng)3 h.最后加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.5 mmol/L，15 ℃過夜培養(yǎng).取200 μL菌液，離心棄上清，SDS-PAGE電泳分析.

1.2.3 GST-NAP融合蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液用50 mL離心管分裝，4 000 rpm離心5 min，棄上清.用5 mL GST binding buffer(含有1% Triton X-100的PBS)重懸沉淀，-20 ℃凍存過夜.室溫解凍后用40 mL GST binding buffer重懸，冰浴條件下使用300 W短脈沖超聲處理(超聲處理10 s，間隔15 s)重復(fù)20～30次至菌液透明.將超聲破碎后的菌體于4 ℃、9 000 rpm離心20 min，取上清置于另一無菌的50 mL離心管中，沉淀用5 mL GST binding buffer重懸，分別對超聲上清和沉淀物進(jìn)行可溶性及超聲破碎效果分析.取1 mL谷胱甘肽瓊脂糖樹脂加入到3 mL層析柱中，制備簡易重力親和層析柱.使用10 mL GST binding buffer平衡層析柱，加入菌體上清25 mL，經(jīng)10 mL GST binding buffer洗滌后，使用12 mL Elution buffer(10 mmol/L還原型谷胱甘肽，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脫得到GST-NAP，并用PBS進(jìn)行透析.純化后的蛋白通過SDS-PAGE驗(yàn)證.

1.2.4 Prescission protease柱上切割GST-NAP融合蛋白 在1 mL層析柱中加入400 μL GST樹脂，將純化透析后的GST-NAP按照純化步驟進(jìn)行平衡、上樣、洗滌.配制酶切反應(yīng)體系(PP酶10 μL，10×cleavage buffer 50 μL，ddH2O 440 μL)加入到層析柱中，4 ℃反應(yīng)16 h后，分多管收集流出液，并用Elution buffer洗脫蛋白.流出液及洗脫蛋白通過SDS-PAGE驗(yàn)證.

1.2.5 Western Blot鑒定NAP蛋白 將流出液經(jīng)SDS-PAGE分離后，在110 V、65 min條件下轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(NC)上，用1%BSA室溫封閉1.5 h；使用TBST(含0.9% NaCl的10 mmol/L Tris溶液加入適量Tween-20，PH 7.4)以1∶8 000稀釋的兔抗NAP抗體常溫孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min；再用TBST以1∶8 000稀釋的羊抗兔IgG常溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色反應(yīng)曝光.

2 結(jié)果

2.1 HP-NAP基因的擴(kuò)增

以pMAL-C2X-NAP質(zhì)粒為模板，使用帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的435 bp片段，與目標(biāo)條帶大小一致(圖1).

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-NAP的酶切鑒定

利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)將HP-NAP片段克隆到pGEX-6P-1質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌落，搖菌提取質(zhì)粒，用SalⅠ和EcoRI雙酶切進(jìn)行鑒定，如圖2所示結(jié)果.經(jīng)雙酶切后得到兩條條帶，分別為5 000 bp(載體pGEX-6P-1)和435 bp(目的基因NAP).將重組質(zhì)粒測序并在Genbank數(shù)據(jù)庫中使用同源性分析軟件BLAST比對測序結(jié)果，目的片段序列與數(shù)據(jù)庫中的HP-NAP基因序列完全一致.

2.3 GST/NAP融合蛋白的表達(dá)、鑒定及可溶性分析

構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGEX-NAP轉(zhuǎn)化BL21，挑取單菌落，擴(kuò)培后提取質(zhì)粒，用NAP特異性引物進(jìn)行PCR鑒定.對于鑒定正確的菌株，用IPTG對菌株進(jìn)行15 ℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，SDS-PAGE結(jié)果顯示在43 kD處可見明顯的蛋白條帶，其與目標(biāo)蛋白GST-NAP融合蛋白大小一致(圖3).同時(shí)，菌體經(jīng)超聲破碎后離心，對其沉淀物和上清進(jìn)行SDS-PAGE，在43 kD處均出現(xiàn)條帶，且在同等上樣條件下，上清中的目標(biāo)蛋白條帶更為明顯.結(jié)果顯示，在15 ℃誘導(dǎo)條件下，GST-NAP融合蛋白主要以可溶的形式存在，如圖4所示.

2.4 GST-NAP融合蛋白純化

取1 mL谷胱甘肽瓊脂糖樹脂加入到3 mL層析柱中，制備簡易重力親和層析柱.使用10 mL GST binding buffer平衡層析柱，加入2.3中制備的菌體上清25 mL，經(jīng)10 mL GST binding buffer洗滌后，使用12 mL洗脫液洗脫.對洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，顯示在43 kD處有唯一一條蛋白條帶(圖5).結(jié)果表明，經(jīng)親和層析得到了純化的GST-NAP融合蛋白.

2.5 Prescission protease柱上切割GST-NAP融合蛋白

在1 mL層析柱中加入400 μL樹脂，按照純化步驟進(jìn)行平衡、上樣(純化透析后的GST-NAP)、洗滌，然后加入PP酶切反應(yīng)體系，4 ℃反應(yīng)16 h后，分多管收集流出液，使用Elution buffer洗脫蛋白.流出液及洗脫蛋白經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，17 kD的NAP單體存在于流出液中，洗脫蛋白為26 kD的GST標(biāo)簽(圖6).

2.6 Western Blot 鑒定NAP蛋白

將流出液經(jīng)SDS-PAGE分離后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL曝光處理得到Western Blot結(jié)果.兔抗NAP抗體與流出液中的NAP蛋白特異性結(jié)合，表明PP酶柱上切割成功獲得NAP蛋白(圖7).

3 討論

由于目前大量獲取HP-NAP較為困難，不利于研究應(yīng)用.因而，本研究嘗試用簡便、高效的大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-6P-1構(gòu)建重組載體pGEX-NAP，通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化得到大量的GST-NAP，經(jīng)Prescission蛋白酶柱上切割GST標(biāo)簽后，成功得到HP-NAP.

在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)過程中，當(dāng)使用37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，在0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.3 mmol/L，0.4 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG濃度下， GST-NAP融合蛋白均為不可溶的包涵體蛋白.為了避免后續(xù)的變復(fù)性工作，嘗試了低溫誘導(dǎo)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度降至15 ℃時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物絕大部分為可溶的形式，并且在0.5 mmol/L IPTG條件下可溶性蛋白表達(dá)量最高.隨后對純化后的GST-NAP用Prescission蛋白酶進(jìn)行柱上切割去除GST標(biāo)簽.Prescission蛋白酶能夠識別pGEX-6P-1載體表達(dá)的蛋白序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并且特異性地在Glu和Gly殘基之間進(jìn)行切割[17].Prescission蛋白酶在4 ℃具有最大活性，因此選擇在低溫下進(jìn)行切割.最初嘗試對結(jié)合在1 mL樹脂上的GST-NAP進(jìn)行直接切割，但并未成功，推斷可能是由于酶切體系較小導(dǎo)致柱上切割不理想.隨后嘗試用小體積的樹脂和大于樹脂體積的酶切體系進(jìn)行切割，最終實(shí)現(xiàn)GST-NAP的柱上切割.本研究提供了一種簡便快速獲取HP-NAP的方法，HP-NAP蛋白的表達(dá)純化成功將為下一步研究提供重要的實(shí)驗(yàn)材料.

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(責(zé)任編輯：王浩毅)

Expression of Soluble GST-NAP Fusion Protein and GST-tag-cleavage on Column

HUANG Xiabing1, KANG Qiaozhen1, FU Guo1, JI Zhenyu2, LIU Xin1

(1.LaboratoryofMolecularImmunology,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.InstituteofMedcine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To obtain plenty of HP-NAP (H.pylorineutrophil-activating protein) for research, NAP gene was amplified from pMAL-C2X-NAP vector by PCR, and the recombinant plasmid pGEX-NAP was constructed. After verified by enzyme digestion and gene sequencing analysis, pGEX-NAP was transformed intoE.coliBL21(DE3)and the soluble fusion protein GST-NAP was obtained by inducing with IPTG in low temperature. Then GST-NAP was purified with Glutathione Sefinose Resin, and cleavaged GST-tag with Prescission protease on column. In conclusion, recombinant plasmid pGEX-NAP was successfully constructed and soluble GST-NAP fusion protein was efficiently expressed inE.coli. High purity HP-NAP can be obtained by Prescission protease cleavage on column. NAP protein was recognized by Rabbit anti-NAP mAb using Western Blot.

GST-NAP; recombinant plasmid; protein expression; GST-tag

2015-07-23

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)基金項(xiàng)目，編號2012ZX09103301- 022；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，編號U1204817，81373119．

黃夏冰(1990—)，女，河南漯河人，碩士研究生，主要從事分子免疫研究，E-mail:huangxiabing1990@163.com；通訊作者：劉鑫(1981—)，女，甘肅白銀人，講師，博士，主要從事免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療研究， E-mail：liux@zzu.edu.cn.

黃夏冰，康巧珍，傅國，等.GST-NAP融合蛋白可溶性表達(dá)及柱上切割GST標(biāo)簽[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2015，47(4)：94-98.

Q786

A

1671-6841(2015)04-0094-05

10.3969/j.issn.1671-6841.2015.04.018