胡曉麗，王雪峰，龐偉，韓洋，馬賢德

實(shí)驗(yàn)論著

輸合配穴針刺對(duì)LPS腦損傷幼鼠模型腦組織S100B、NSE表達(dá)的影響

胡曉麗，王雪峰，龐偉，韓洋，馬賢德

目的 探討輸合配穴針刺干預(yù)對(duì)LPS腦損傷幼鼠模型腦組織S100B、NSE表達(dá)的影響。方法 將60只SD新生的乳鼠隨機(jī)分為針刺干預(yù)組、模型組和對(duì)照組，對(duì)干預(yù)組采用輸合配穴針刺21 d后，對(duì)各組大鼠腦組織中S100B、NSE含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 干預(yù)組S100B、NSE的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，且21 d時(shí)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 通過(guò)對(duì)腦損傷模型腦組織S100B、NSE表達(dá)檢測(cè)，明確“輸合配穴”針刺法在早期干預(yù)有效性。

腦損傷； 造模； S100B; NSE; 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)； 幼鼠

小兒腦損傷病因復(fù)雜，多因早產(chǎn)、宮內(nèi)感染、新生兒缺氧缺血性腦病[1]等所導(dǎo)致，雖對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但迄今其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。腦損傷引起患兒的肢體殘障，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)，最大限度的促進(jìn)殘障患兒功能恢復(fù)，尋求合理、有效、副反應(yīng)低的療法仍是康復(fù)界的工作重點(diǎn)。王雪峰教授在多年治療兒童癱瘓性疾病臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用輸合配穴針刺療法治療小兒癱瘓性疾病，取得顯著療效，為進(jìn)一步探討其針刺的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用給予孕鼠腹腔注射脂多糖(LPS)的方法模擬腦損傷幼鼠動(dòng)物模型[2-4]，采用“輸合配穴”針刺法早期干預(yù)，為運(yùn)用輸合配穴針刺療法早期干預(yù)治療腦損傷患兒提供更有利的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及制備 LPS(Lipopolysaccharides，Escherichia coli 055：B5，由Sigma公司提供)，每1 mg LPS溶于10 mL生理鹽水中。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD新生的乳鼠60只(購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2010-0001)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組20只。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 針刺干預(yù)組：乳鼠出生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射LPS(30，30，60，60，120 μg/kg)連續(xù)注射以防止產(chǎn)生耐藥性[1]。于生后第3天始，采用手陽(yáng)明經(jīng)和足陽(yáng)明經(jīng)的輸穴和合穴，即取雙側(cè)曲池穴、三間穴、后三里穴、陷谷穴(按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的動(dòng)物穴位標(biāo)準(zhǔn))，采用1寸毫針捻轉(zhuǎn)進(jìn)針，直刺穴位0.1～0.3寸，曲池穴、足三里穴采用補(bǔ)法針刺1～2 min，不留針；三間穴、陷谷穴采用瀉法針刺1～2 min，不留針。(為避免手法差異，針刺由針灸系畢業(yè)生1人操作)，從出生后第3天開(kāi)始針刺，每日1次，連續(xù)21 d；生后3 d開(kāi)始，每日進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)鑒定，分別于1、7、14、21 d取乳鼠腦組織實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

模型組：乳鼠出生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射LPS(30，30，60，60，120 μg/kg)連續(xù)注射以防止產(chǎn)生耐藥性，生后3 d開(kāi)始，每日進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)鑒定，分別于1、7、14、21 d取乳鼠腦組織實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

對(duì)照組：乳鼠生后第3、4、5、6、7天，每天腹腔注射同等劑量的生理鹽水。生后3 d開(kāi)始，對(duì)照組乳鼠在每日進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)鑒定，分別于1、7、14、21 d取乳鼠腦組織實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè) 平面翻正：將乳鼠翻轉(zhuǎn)放置桌面上，其背部向下，記錄乳鼠由仰臥位變成俯臥位時(shí)四只爪接觸平臺(tái)的時(shí)間。懸吊試驗(yàn)：使乳鼠前腿抓住一水平的玻璃棒(直徑0.5 cm)，離開(kāi)桌面45 cm，記錄乳鼠掉下的時(shí)間，并進(jìn)行評(píng)分。曠野試驗(yàn)：裝置為36 cm×36 cm×36 cm無(wú)頂方盒，箱底用墨線分成9個(gè)等分小格，將乳鼠置于中央小方格內(nèi)，觀察3 min內(nèi)活動(dòng)情況。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：乳鼠1/2以上身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格記1分；乳鼠后肢站立計(jì)1分；二者相加為其總分。斜坡試驗(yàn)：將乳鼠頭向下倒置于45°的斜坡上，記錄乳鼠轉(zhuǎn)為頭向上>135°的時(shí)間。

1.3.3 檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腦組織中的星形膠質(zhì)源性蛋白(S100B)及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)吸光值。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)幼鼠神經(jīng)發(fā)育測(cè)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05;與模型組比較，bP<0.05。

表1結(jié)果表明，干預(yù)組和模型組與對(duì)照組比較平面翻正測(cè)試比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第7天平面翻正測(cè)試，干預(yù)組與模型組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第14天，干預(yù)組與模型組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2結(jié)果表明，與對(duì)照組比較懸吊實(shí)驗(yàn)、斜坡實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第14天干預(yù)組與模型組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第21天懸吊實(shí)驗(yàn)、斜坡實(shí)驗(yàn)干預(yù)組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 不同時(shí)點(diǎn)S100B，NSE的表達(dá)結(jié)果分析 見(jiàn)表3、表4。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

表3結(jié)果表明，模型組S100B的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，第1、14天模型組與干預(yù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在21 d時(shí)，模型組與干預(yù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表4結(jié)果表明，模型組NSE的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，第1、14天模型組與干預(yù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在21 d時(shí)，模型組與干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

腦損傷綜合征是近年來(lái)在診斷高危兒患有腦性癱瘓、行為異常、運(yùn)動(dòng)障礙所引入過(guò)渡性診斷，多因早產(chǎn)、宮內(nèi)感染、新生兒缺氧缺血性腦病等所導(dǎo)致，常用于小于6個(gè)月的嬰兒，其神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥日益受到重視。

本文依據(jù)文獻(xiàn)的方法，建立LPS感染幼鼠模型，采用輸合配穴針刺進(jìn)行干預(yù)，觀察其神經(jīng)發(fā)育測(cè)試結(jié)果及腦組織中S100B、NSE表達(dá)，為針刺在小兒癱瘓性疾病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。傳統(tǒng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)“腦損傷”無(wú)專著論述，但在歷代醫(yī)籍中均有不少記載，多將其歸屬于“五遲五軟”“五硬”“痿證”的范疇，中醫(yī)認(rèn)為因小兒脾常虛，肝常余，肢體強(qiáng)硬，步履不正，病機(jī)主要責(zé)之于肝強(qiáng)脾弱。因而在治療上，應(yīng)以柔肝健脾，抑木扶土為主。五輸穴在全身腧穴中占有極其重要的位置，五輸穴與五行相配伍，如陽(yáng)經(jīng)，合穴屬土，輸穴屬木，并根據(jù)中醫(yī)的上病下取之原理，肘膝關(guān)節(jié)以下腧穴既可治療局部病，也可治療遠(yuǎn)部病，從而達(dá)到和內(nèi)調(diào)外，標(biāo)本兼治的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)提出輸合配穴-抑木扶土針刺法，通過(guò)瀉輸補(bǔ)合可直接達(dá)到抑木扶土之效，即所謂“陰平陽(yáng)秘，精神乃治”。

血清S100B及NSE在腦組織中具有高度特異性，對(duì)腦損傷高度敏感[5]，在血清中迅速出現(xiàn)，確保血清濃度和組織損傷之間有可預(yù)測(cè)的關(guān)系，是目前具有較高敏感性和特異性的最具應(yīng)用前景的腦損傷標(biāo)記物，對(duì)腦損傷的診斷及傷情評(píng)估具有重要的臨床價(jià)值，且與神經(jīng)元的損傷呈正相關(guān)，提示其可作為神經(jīng)元細(xì)胞受損的早期指標(biāo)之一[6]，所以本次實(shí)驗(yàn)選用此指標(biāo)來(lái)檢測(cè)所造模型鼠的腦損傷程度。

結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的腦組織S100B、NSE含量測(cè)定與對(duì)照組相比均有顯著差異，顯示模型組造成新生仔鼠腦損傷，通過(guò)對(duì)各組平面翻正試驗(yàn)、懸吊實(shí)驗(yàn)，斜坡實(shí)驗(yàn)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)鑒定表明，使用“輸合配穴”針刺法早期干預(yù)有效。今后將進(jìn)一步研究脂多糖造成宮內(nèi)感染模型，對(duì)其劑量及感染機(jī)制進(jìn)一步研究。

[1] 肖欽志.腦性癱瘓病因?qū)W研究進(jìn)展[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，33(3)：204-208.

[2] 李曉捷，高晶，孫忠人.宮內(nèi)感染致早產(chǎn)鼠腦癱動(dòng)物模型制備及其鑒定的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2004，19(12)：885-889.

[3] Johnston MV, Ferriero DM, Vannucci SJ,et al. Models of cerebral palsy: which ones are best[J].J Child Neurol，2005，20(12)：984-987.

[4] Rees S, Harding R, Walker D.The biological basis of injury and neuroprotection in the fetal and neonatal brain[J].Int J Dev Neurosci，2011，29(6)：551-563.

[5] 李楠，王雪峰，張亮，等.輸合配穴針刺法促進(jìn)LPS早產(chǎn)鼠腦損傷中CNP及MBP表達(dá)的研究[J].山東醫(yī)藥，2012，52(36)：55-57.

[6] 尤玉慧，崔志慧，尹水貴，等.0～6個(gè)月齡腦癱高危兒血清NSE表達(dá)特點(diǎn)及臨床價(jià)值[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42(6)：98-101.

(本文編輯：李志文)

Effects of combined transport acupuncture on the expression of S100B, NSE and LPS of brain tissue of young rats with cerebral injury model

HUXiao-li,WANGXue-feng,PANGWei,etal.

PediatricdepartmentoftheAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，110032Shenyang，China

Objective To research the effect of acupuncture intervention on the expression of S100B、NSE of different types of brain injury model in rat brain tissue.Methods According to the model preparation method is divided into premature intervention group and non intervention group, LPS premature intervention group and non treatment group, Ischemia and hypoxia group and untreated group, LPS intervention group and the non intervention group, the normal group. The method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect S100B、NSE content in brain tissue of rats in different group.Results Rats S100B, NSE expression was closely correlated with the severity of brain injury.The expression of S100B、NSE in model group, was significantly higher than that in the blank control group (P<0.01).The results showed: the expression of S100B、NSE in brain tissue was lower than non intervention group expression in the acupuncture intervention group on twenty-first day.Conclusions The premature delivery to hypoxia and ischemia, rats, lipopolysaccharide infection detection of brain injury.S100B、NSE are not consistent in various model,maybe that related to the severity of brain injury related model.Brain tissue S100B、NSE expression was lower than non intervention group expression in the acupuncture group, which can demonstrate the use of "shu and he point" early intervention of acupuncture effectively.

brain injury； animal model； S100B； NSE； animal experiments； mice

遼寧省教育廳基金資助(L2012336) 作者單位：110032 沈陽(yáng)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科(胡曉麗，王雪峰)；154007 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學(xué)兒童神經(jīng)康復(fù)實(shí)驗(yàn)室(龐偉)；110032 沈陽(yáng)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(韓洋)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(馬賢德)

胡曉麗(1979-)，女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師。研究方向：小兒癱瘓性疾病的中醫(yī)藥防治。

王雪峰，110032 沈陽(yáng)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.01.008

R-33

B

1674-3865(2015)01-0020-03

2014-09-29)