綜 述

循環(huán)miR-208在心血管疾病中的價值探索

1 前言

自從1954年發(fā)現(xiàn)天冬氨酸轉氨酶活性在急性心肌梗死患者血清中升高以來，已經(jīng)有越來越多的心臟標記物被發(fā)現(xiàn)，并在心臟病的診斷、治療和預測中發(fā)揮著至關重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)細胞可通過分泌形式使微小RNA（miRNA）進入外周血并在外周血中穩(wěn)定存在，因而使其具有潛在診斷疾病的意義。隨著miRNA在心臟發(fā)育及心血管疾病發(fā)生發(fā)展中功能的逐步闡明，加之miRNA檢測手段的不斷成熟，人們開始將目光轉向了心血管疾病miRNA標志物的發(fā)掘，并很快取得了一定的進展。研究發(fā)現(xiàn) miRNA（miR-208a、miR-208b）特異性地表達于心臟，但其是否在急性心肌梗死患者的早期外周血中就有升高及這種升高是否具有診斷意義近幾年才得到大量學者的注意。2009年Naoharu課題組首次將miRNA作為生物標記物引入心血管疾病的診斷鄰域，之后國內外研究者相繼報道了有關急性心肌梗死（AMI）循環(huán)miRNA的診斷研究。結果顯示，循環(huán) miR-499、miR-208a、miR-208b 在早期心肌缺血后即刻升高，診斷效能優(yōu)于目前臨床常用的心肌缺血生物標記物，如超敏心肌肌鈣蛋白T highsensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT）、肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白等[1-3]。所以miRNA的發(fā)現(xiàn)為臨床早期診斷心血管疾病提供了一個全新的思路，為更進一步揭示心血管疾病的病理生理過程提供了新的研究途徑。

2 MiR-208的生物學效應

MiRNA是小的、內源性轉錄產物，是基因表達的調控者，在真核生物中普遍存在[4]。其作為一種微型調節(jié)分子，在轉錄水平調控蛋白質的表達，進而參與幾乎所有生命體的生理和病理過程。這些長20～24個核苷酸（nt）的RNA基因主要位于蛋白質編碼基因的內含子區(qū)和基因間隔區(qū)，主要由RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）轉錄，也有一些由RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）轉錄，它們可調節(jié)許多生理過程，包括細胞增殖、分化、凋亡和發(fā)育[5-7]。編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的輔助下形成3′polyA尾及5′加帽的初級miRNAs（pri-miRNA），并伴有蛋白編碼基因合成。隨后pri-miRNA折疊成具有獨特發(fā)夾的二級結構，這些發(fā)夾是pri-miRNA的特異性結構，憑此可與細胞核中其他RNA相區(qū)別。這種結構可被一種微型處理復合體識別和剪切，該復合體由核糖核酸酶Drosha（核糖核酸酶Ⅲ/RNaseⅢ）、RNA結合蛋白DGCR8和其他蛋白質構成[8,9]。剪切后得到一段長約60 nt的莖-環(huán)狀的前體miRNA（pre-mi RNA）[9]，pre-miRNA通過GTP依賴性核質/細胞質轉運蛋白Exprotin-5從核膜轉運至胞質[10]。PremiRNA進入細胞質后被核糖核酸酶Dicer（另一種RNaseⅢ）切割形成19～24 nt的雙鏈成熟miRNAs。

MiR-208是由2個成員構成的高度保守的miRNA家族，稱為miR-208a和miR-208b。兩者具有極為相似的核苷酸序列[11]。2009年以前認為miR-208只由單獨的一個成員構成，直到2009年該家族中另外一個成員才被發(fā)現(xiàn)，至此miR-208被重新命名為miR-208a，新成員命名為miR-208b[12]。后來，另一種稱為miR-499的miRNA基于其序列同源性和組織表達形式的相似性也被納入該家族當中。MiR-208a在心臟中通過Myh6基因的第29號內含子編碼并表達，miR-208b則通過Myh7基因的第37號內含子編碼并在心臟和骨骼肌中表達[12]。該家族的第3號成員miR-499由與前者緊密相關的基因Myh7b的第19號內含子編碼。這三種miRNAs（miR-208a、miR-208b、miR-499）依次控制著心臟的肌球蛋白容量、肌纖維和肌肉性能[13]。在嚙齒類動物，miR-208b在胚胎心臟中大量表達，直到成年它的表達水平下降；相反，miR-208a在心臟的發(fā)育期只處于低表達水平，而在成年后成了主要的表達基因。從胚胎期miR-208b的表達到出生后miR-208a表達的轉換表明，miR-208a和miR-208b以相同的mRNAs為靶點，只是在不同的發(fā)育時期表現(xiàn)不同而已[14]。這清楚地揭示，miR-208b通過緩慢激活和快速抑制的肌纖維基因程序在心肌纖維特性的表達中起著關鍵性的作用。

3 MiR-208與心血管疾病的關系

最新研究表明，miRNA可穩(wěn)定存在于人類血液、唾液、尿液等體液中，作為生物標志物用于腫瘤、肌肉損傷、炎癥疾病等多種疾病[15,16]。MiRNAs是多種疾病調節(jié)因子，在心血管疾病中的作用也越來越被研究者重視。特別是在miRNAs與動脈粥樣硬化斑塊的形成、心梗后血管再生與miRNAs的病理生理機制，miRNAs參與心肌重構的發(fā)生發(fā)展方面吸引了很多目光。2007年Van Rooij鑒定出心臟特異表達的miRNA——miR-208。研究表明，在心臟中miR-208a的表達不僅僅受發(fā)育調節(jié)，并且在一些病理過程中將喪失這種調節(jié)。心肌的收縮性依賴于MHC兩種亞型即a-MHC和b-MHC的表達，兩者比例的變化將導致心肌過度肥大、纖維化和對心臟收縮功能的嚴重影響。的確，心肌中b-MHC表達的增加是心肌肥厚和心衰的共同特征，最終將導致心輸出量的降低和造成終末期心衰微弱的收縮功能。在成人心臟中，機械應激和甲狀腺功能減退都可誘發(fā)a-MHC亞型到b-MHC亞型的轉換[9]。

在小鼠中miR-208a基因的丟失可導致大量快骨骼肌收縮蛋白基因的顯著表達，而這些基因在正常情況下是不表達的。通過對Med13（也被稱為THRAP1）的直接抑制可誘導這種骨骼肌基因序列的激活。Med13是一種甲狀腺激素胞核受體。在成人心臟中Med13參與甲狀腺激素的信號傳導以此來抑制b-MHC的表達。然而在心臟，miR-208a的過度表達將造成Med13的顯著表達從而導致b-MHC表達的增加。所以，miR-208a高水平的表達與小鼠心臟的心率不齊、心肌纖維化和肥大性生長相關，并與擴張型心肌病患者的不良臨床后果也具有一定相關性。因此，miR-208a的高水平表達可作為心臟性死亡和心衰的有力預測因子[17]。另一方面研究表明，miR-208b與心肌纖維、心肌肥厚、心力衰竭和心肌缺血形成有關[18]。王大志課題組的研究發(fā)現(xiàn)，miR-208家族的兩個亞型miR-208a和miR-208b分別由位于α亞型肌球蛋白重鏈和β亞型肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain）基因的內含子編碼，并且miR-208a與α亞型肌球蛋白重鏈之間存在協(xié)同表達；同時證明miR-208a通過靶向作用于GATA結合蛋白4（GATA4），調節(jié)心臟轉錄因子的表達，進而在心肌肥厚性增長和心臟傳導系統(tǒng)中發(fā)揮重要調節(jié)作用[19]。2009年8月，Naoharu課題組以大鼠為研究對象，芯片分析大鼠各組織miRNA的表達譜，確定miR-208特異性表達于心臟，并實驗驗證該miRNA是否能作為心肌損傷的診斷標志物。結果發(fā)現(xiàn)，正常大鼠血漿檢測不到miR-208，異丙腎上腺素處理后明顯升高，3 h達到峰值，24 h后明顯下降，但仍然保持較高水平，與cTnI的變化呈現(xiàn)良好的相關性。此外研究人員發(fā)現(xiàn)，在腎梗模型、雙腎切除和心肌肥大模型大鼠的血漿中檢測不到miR-208，進而證明miR-208作為心肌損傷的特異性標志物，不會受到非特異性損傷的干擾，也不受腎功能的影響[20,21]。也有研究表明，體外采用大鼠H9c2細胞，用TritonX-100破壞大鼠H9c2細胞，觀察細胞培養(yǎng)液中miR-208b的變化趨勢和表達量改變，發(fā)現(xiàn)隨著TritonX-100濃度的增加，大鼠H9c2心肌細胞壞死數(shù)量增加，細胞上清液miR-208b含量增加，心肌細胞壞死數(shù)量與細胞上清液miRNAs含量呈正相關，從而揭示急性冠脈綜合征（ACS）患者血漿miR-208b可以從受損心肌細胞釋放入血，導致血漿中相應表達水平變化，miR-208b可能作為ACS患者診斷及急性心梗和心衰鑒別診斷的敏感指標。

4 MiR-208與AMI的早期診斷

以往研究提示，循環(huán)miRNA可能是在磷脂雙分子膜的保護下，以分泌體或微小泡的形式穩(wěn)定存在于血漿中，從而可耐受諸如反復凍融、極端pH（pH 1～13），以及核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶處理3 h；與此同時，試劑盒的逐漸推廣大大簡化了循環(huán)miRNA的提取步驟，這些都使那些易在血漿中檢出的心臟特異性miRNA得到更多的關注[22]。另一方面，目前臨床所應用的AMI實驗室標記物在患者癥狀發(fā)作后的4 h內并不是持續(xù)升高，這就需要反復檢測，阻礙了AMI早期診斷[23]。鑒于AMI起病急、發(fā)病率高和病死率高等特點，早預防、早診斷，以及科學的評估預后控制其發(fā)生發(fā)展顯得尤為重要。因此，深入研究新的具有高診斷效能的實驗室標記物不僅具有學術價值，更具有應用前景。

Devaux等[24]選取了胸痛發(fā)作＜12 h，確診AMI的510例患者作為試驗組，其中ST段抬高心肌梗死（STEMI）397 例，非 STEMI（NSTEMI）113 例；對照組選取87名健康志愿者。就診后即刻采血、離心提取血漿，檢測miRNA。研究發(fā)現(xiàn)，所有AMI患者的miR-208b較對照組顯著升高（＞105倍），并且在對照組中幾乎檢測不到。進一步研究發(fā)現(xiàn)，STEMI患者的miR-208b較NSTEMI患者顯著升高（＞8倍），差異有統(tǒng)計學意義。另一方面，miR-208b與傳統(tǒng)AMI標記物具有顯著相關性，其中與hs-cTnT初始濃度呈正相關。為了進一步確認miR-208a作為心梗標志物的特異性，Qing研究組檢測了急性腎損傷8例）、慢性腎功能衰竭（11例）、卒中（11例）、外傷（9例）患者血漿中該miRNA的含量，結果在這些患者中均檢測不到循環(huán)miR-208a的存在。這提示miR-208a是一個診斷急性心梗更為可靠的生物標志物。為了驗證miR-208a是否能夠更早反映急性心梗的發(fā)生，他們檢測了急性心?；颊咝赝窗l(fā)生早期（3例）血漿中的miR-208a，發(fā)現(xiàn)該miRNA能夠比cTnI更為快速（1～4 h）地反映急性心梗的發(fā)生。對急性心?；颊撸?例）治療（經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和常規(guī)藥物治療）出院后的2個月隨訪發(fā)現(xiàn)，血清中檢測不到miR-208a的存在。而需要指出的是，動物學實驗表明，冠狀動脈結扎1 h后血漿miR-208a含量便開始升高，3 h達峰值，6～12 h開始下降，24 h恢復到檢測不到的水平[25]。這提示，miR-208a同樣對心梗臨床治療效果的評估及預后意義可能不是很大，miR-208a可能更適用于早期診斷[26]。

5 展望

越來越多的研究顯示，AMI發(fā)生后心臟特異性循環(huán)miRNA表達明顯升高，其診斷效能不俗。這門新興的研究日趨成熟，并且更為經(jīng)濟的檢測技術也在不斷開發(fā)中。國外已有研究報道，可以檢測AMI患者尿中miRNA的含量變化做出診斷，從而使檢測技術更加簡單化。深入研究心臟特異性循環(huán)miRNA在AMI診療評估體系中的作用，協(xié)同目前臨床應用ACS風險評估，例如GRACE和HEART評分系統(tǒng)，更是具有重大的臨床意義。有理由相信在不久的將來，心臟特異性循環(huán)miRNA將很有可能成為AMI新型實驗室標記物。

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The value exploration of circulation miR-208 in cardiovascular disease

張一凡 謝蓮娜 司瑞 郭文怡

微小RNA； 心血管疾病； 急性心肌梗死； 早期診斷

MicroRNA； Cardiovascular disease； Acute myocardium infarction； Early diagnosis

116001 遼寧省大連市，大連大學附屬中山醫(yī)院循環(huán)四科

謝蓮娜，E-mail：xieln1963@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．08．002

R54

A

1672-5301（2015）08-0678－04

2015-04-08）