周怡　夏陽(yáng)　章非敏

三維打印技術(shù)在骨組織工程中的應(yīng)用及進(jìn)展

周怡夏陽(yáng)章非敏

組織工程；生物相容性材料；細(xì)胞因子類；計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)；三維打印

創(chuàng)傷、炎癥和腫瘤等病理性因素或先天因素導(dǎo)致的骨缺損的治療，特別是大段骨缺損的治療是臨床上的難點(diǎn)之一?，F(xiàn)有骨缺損治療方法主要包括骨移植 （自體、同種異體和異種骨移植）、植入人工生物材料和牽張成骨等，但均不能取得滿意的效果［1］。近年來(lái)，快速發(fā)展的骨組織工程技術(shù)為骨缺損的修復(fù)提供了一種新的方法。骨組織工程包括種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子三個(gè)基本要素。支架材料作為骨組織工程的基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)特征對(duì)骨缺損修復(fù)的最終效果具有非常重要的影響。隨著影像技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)和材料工程的發(fā)展，三維打印技術(shù)開始應(yīng)用于骨組織工程，給予制備生物學(xué)性能更佳的個(gè)性化骨組織工程支架以新希望。

一、三維打印技術(shù)

三維打印技術(shù) （three-dimensional bioprinting，3 D bioprinting）是根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì) （computer aid design，CAD）模型，或計(jì)算機(jī)斷層掃描 （computed tomog-raphy，CT）、磁共振成像 （magnetic resonance imaging，MRI）等數(shù)據(jù)重建的模型，使用計(jì)算機(jī)控制的打印系統(tǒng)進(jìn)行三維打印，通過(guò)材料精確的分層堆積，快速制造任意復(fù)雜形狀三維物體的數(shù)字化成型技術(shù)［2-3］，包括選擇性激光燒結(jié) （selective laser sintering，SLS）、熔融沉積成型 （fused deposition modeling，F(xiàn)DM）、光固化成型 （stereolithography appearance，SLA）和金屬直接熔融等多種技術(shù)。三維打印技術(shù)已逐步應(yīng)用于航天、軍工、醫(yī)療和建筑等各個(gè)領(lǐng)域，并且隨著新材料的發(fā)展，打印材料由金屬、塑料等非生物材料發(fā)展到凝膠、細(xì)胞等生物材料，以及最近的 DNA 水凝膠材料。由于三維打印技術(shù)具有精度高、速度快和可定制等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多地運(yùn)用到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

在醫(yī)學(xué)影像技術(shù)和數(shù)字化醫(yī)學(xué)的輔助下，三維打印的疾病模型為醫(yī)生提供了更全面、更直觀的信息，便于醫(yī)患之間的交流。臨床醫(yī)生甚至可以利用模型進(jìn)行模擬手術(shù)，以制訂更優(yōu)的手術(shù)方案，從而縮短手術(shù)時(shí)間，提高手術(shù)成功率，降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生幾率［4-8］。此外，運(yùn)用三維打印模具間接制作的個(gè)性化假體已用于臨床。王臻等［9］通過(guò) CT 掃描獲得患者的股骨髁數(shù)據(jù)，進(jìn)行矢量化三維重建并在計(jì)算機(jī)輔助下設(shè)計(jì)人工關(guān)節(jié)面，三維打印完成光敏樹脂原型后翻制陰模，鑄造獲得個(gè)性化鈦合金關(guān)節(jié)，植入患者體內(nèi)后隨訪 16 個(gè)月，膝關(guān)節(jié)功能良好?？梢姡柚S打印模型制造個(gè)性化金屬植入物方法可行，但流程比較繁瑣。逐漸成熟的金屬三維打印技術(shù)可以直接制造金屬植入物作為骨替代物修復(fù)骨缺損。已有研究利用 SLS 技術(shù)打印鎳鈦合金多孔支架，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的生物相容性［10］。直接打印的金屬植入物應(yīng)用于人體的研究尚處于初期。2012 年比利時(shí) Hasselt 大學(xué) BIOMED 研究所［11］基于三維圖像數(shù)據(jù)使用 SLS 法將純鈦超細(xì)粉末熔融成型制備了人工下頜骨，成功實(shí)施了世界首例三維打印人工下頜骨置換術(shù)，手術(shù)的遠(yuǎn)期效果尚待評(píng)估。

三維打印應(yīng)用于骨組織工程，以生物材料或活細(xì)胞或生物材料與活細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行打印，是三維生物打印技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)方面。三維生物打印技術(shù)一般采用噴墨打印、微擠壓成型和激光輔助三種方法，其中最常用的是噴墨打印技術(shù)［12］。生物三維打印技術(shù)尚處于起步階段，其主要挑戰(zhàn)是研究與生物材料相容的打印方法以及研發(fā)同時(shí)滿足機(jī)械和生物性能要求的新材料，最終實(shí)現(xiàn)復(fù)雜三維生物結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，如個(gè)性化植入體、組織工程骨、人工器官和體外仿生模型等。

二、骨組織工程

骨組織工程主要是研制骨替代物即組織工程骨來(lái)修復(fù)骨缺損，其基本原理是在體外構(gòu)建支架材料-種子細(xì)胞-細(xì)胞因子的復(fù)合物，然后移植到骨缺損區(qū)，通過(guò)支架的降解和新骨的形成，以新生骨組織替代支架材料，從而修復(fù)缺損骨的形態(tài)和功能［13］。在骨組織工程中，支架作為一個(gè)暫時(shí)的、人工的細(xì)胞外基質(zhì)起到促進(jìn)新骨形成的作用［14］。其主要功能是為種子細(xì)胞提供合適的場(chǎng)所、促使其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。它作為組織工程骨再生的框架，直接影響細(xì)胞的增殖和分化，是骨組織工程中的關(guān)鍵要素［15］。理想的支架應(yīng)具有仿生的梯度結(jié)構(gòu) （梯度功能材料）、孔隙率高且孔徑適宜、機(jī)械強(qiáng)度和降解速度與組織匹配以及良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)活性［16］。主要評(píng)價(jià)因素如下［17］：孔徑大小、孔隙率、孔道連通程度及扭曲度、孔分布的均勻性和支架的比表面積等。而支架的構(gòu)建以往多采用單純的鑄造技術(shù)，須借助于陰模翻制出各種形狀，通過(guò)粒子浸出法、冷凍干燥法等方法獲得支架內(nèi)孔隙［18］，無(wú)法控制材料的孔隙大小和相互貫通性，也無(wú)法定制支架的外形。

三、三維打印技術(shù)與骨組織工程

三維打印技術(shù)借助影像學(xué)手段獲得骨缺損的數(shù)據(jù)，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)出待建的三維結(jié)構(gòu)，選用合適的材料，采用三維打印構(gòu)建骨組織支架。與傳統(tǒng)方法相比其具有極大的優(yōu)勢(shì)［19］：自動(dòng)化制造，過(guò)程簡(jiǎn)化、速度加快，具有可控性和可重復(fù)性；不依賴于特殊模具，打印的支架可以根據(jù)患者骨缺損的大小和形狀“量身定制”；可以構(gòu)建復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，獲得合適的孔隙率和孔徑；不同的細(xì)胞、細(xì)胞因子甚至基因都可以同步打印到支架的特點(diǎn)部位。

1. 三維打印生物材料：應(yīng)用于骨組織工程中的打印材料需具備足夠的機(jī)械強(qiáng)度與成骨能力，具有合適的降解速率以配合骨組織的構(gòu)建，一般可分為人工合成和天然材料兩大類。人工合成材料有聚乳酸 （polylactic acid，PLA）、聚羥基乙酸 （polyglycolic acid，PGA）及其共聚物 （polylactide-glycolide acid，PLGA）、聚己內(nèi)酯 （polycaprolactone，PCL）、羥基磷灰石 （hydroxyapatite，HA）、磷酸三鈣 （tricalcium phosphate，TCP）等。天然材料包括膠原、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鹽等。人工合成和天然材料各有優(yōu)缺點(diǎn)［20-21］。人工合成材料的機(jī)械性能較好，但生物學(xué)性能欠佳；天然材料需解決抗原性和機(jī)械性能差的問(wèn)題。目前，尚無(wú)完全滿足要求的理想支架材料，一般采用兩種或兩種以上材料復(fù)合的方法來(lái)彌補(bǔ)單一材料的缺陷。

PLA、PGA 和 PLGA 是目前應(yīng)用較廣泛的幾種合成高分子支架材料，生物相容性較好，降解產(chǎn)物無(wú)毒，可通過(guò)體內(nèi)代謝排除。PLGA 的降解速率可通過(guò)改變 PLA、PGA的比例來(lái)調(diào)控。但是這類材料存在缺點(diǎn)，如親水性差、機(jī)械強(qiáng)度不足、酸性代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利等［15］。近年來(lái)對(duì) PLGA 的應(yīng)用有廣泛的研究。Xu 等［16］采用低溫沉積，將熱致相分離與三維打印技術(shù)結(jié)合，制備出一種天然珍珠 / PLGA 的復(fù)合三維支架，具有高的孔隙率 （81.98± 3.75）%，合適的孔徑 ［ 大孔徑 （495±54）μm，微孔徑＜10 μm ］ 和機(jī)械性能 ［ 抗壓強(qiáng)度 （0.81±0.04）mPa，彈性模量 （23.14±0.75）mPa ］，接種骨髓干細(xì)胞于其上進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞獲得良好的增殖與分化，證明其具有較好的生物相容性及骨誘導(dǎo)活性，能滿足骨組織工程支架的要求。

羥基磷灰石具有生物相容性好、硬度大的特點(diǎn)，可用于承重部位，但是也有脆性大、不易塑型和難降解等不足［21］。Leukers 等［22］打印出羥基磷灰石三維支架，小鼠胚胎成骨細(xì)胞可在其上良好增殖，對(duì)羥基磷灰石支架在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用具有重要意義。

膠原是一種天然蛋白質(zhì)，具有優(yōu)越的生物相容性和可降解性，廣泛應(yīng)用于骨組織工程支架材料。但其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)強(qiáng)度較差，不能滿足骨組織工程修復(fù)材料的要求，因而常用于復(fù)合支架的制備中，以增強(qiáng)材料的生物學(xué)性能。Chen 等［23］在 PLGA 支架的三維空隙中構(gòu)筑膠原纖維，提高了 PLGA 材料的親水性。Lee 等［24］采用聚己內(nèi)酯和羥基磷灰石混合材料，打印制備骨-軟骨支架，并在支架的關(guān)節(jié)面灌注 TGF-β3 和膠原，植入兔體內(nèi)，獲得良好的修復(fù)效果，并且動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和承重功能基本正常。Inzana等［25］利用磷酸鈣和膠原的混合物打印網(wǎng)狀支架三維骨模型，植入小鼠股骨缺損處，術(shù)后可見植入物具有良好的機(jī)械性能、生物相容性及可降解性，并具有引導(dǎo)新骨形成的作用。

直接打印骨支架對(duì)材料有較嚴(yán)格地要求，因此，Lee等［26］采用一種間接打印的方法，先用明膠顆粒按所需外形打印出支架的模型，再將材料澆鑄入模型，在空腔內(nèi)制作出最終的支架。這種方法對(duì)材料的選擇更為寬松，可用于制造復(fù)雜支架。

可用于支架打印的材料種類雖多，但單一材料在骨缺損的修復(fù)中各有優(yōu)缺點(diǎn)，復(fù)合支架材料更具優(yōu)勢(shì)。且還有許多難題，如如何形成材料-細(xì)胞的理想界面，如何使材料的機(jī)械強(qiáng)度與降解速度的協(xié)調(diào)匹配，如何確保材料無(wú)致畸性、致癌性等［20］。不同打印技術(shù)對(duì)材料的要求不同，因此需要改進(jìn)打印技術(shù)使打印工藝與材料更相容，在打印后仍保持材料的生物相容性、避免成型產(chǎn)品發(fā)生變形等，這些都是三維打印技術(shù)在制備骨組織支架時(shí)面臨的挑戰(zhàn)。以上問(wèn)題的成功解決將使骨組織支架的性能越來(lái)越完善，能夠更好地應(yīng)用于臨床。

2. 同步打印細(xì)胞和細(xì)胞因子：構(gòu)建組織工程骨的方法以往是在預(yù)先制備好的支架上接種成骨類細(xì)胞，細(xì)胞在生物支架上體外培養(yǎng)后移植到患者體內(nèi)，隨著支架的降解以及細(xì)胞的增殖、分化，最終形成新的骨組織并替代支架材料。這種方法構(gòu)建的簡(jiǎn)單支架已取得了一定的進(jìn)展，但細(xì)胞只是簡(jiǎn)單的隨機(jī)吸附于支架上，并不適宜構(gòu)建復(fù)雜的骨組織支架［27］。三維生物打印技術(shù)可將不同的細(xì)胞堆積在支架的指定位置，并提供支撐基質(zhì)，還可以通過(guò)添加細(xì)胞因子來(lái)調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為，實(shí)現(xiàn)支架材料、細(xì)胞和細(xì)胞因子三要素的同步控制［28］。

近年來(lái)在細(xì)胞打印方面已取得一定的進(jìn)展。Hao 等［29］將兔間充質(zhì)干細(xì)胞包裹于 I 型膠原中與 PLGA-β-TCP 材料復(fù)合，采用低溫沉積制備三維支架修復(fù)兔橈骨缺損，取得了良好的修復(fù)效果。Xu 等［30］采用靜電紡絲技術(shù)制備聚己內(nèi)酯纖維薄膜，然后應(yīng)用噴墨打印技術(shù)將含有兔彈性軟骨細(xì)胞和膠原蛋白的水凝膠循環(huán)交替打印在薄膜表面，制備了具有良好生物學(xué)性能和機(jī)械性能的組織工程軟骨。Gao等［31］將聚乙二醇二甲基丙烯酸酯與具有生物活性的納米粒子混合，并加入人間充質(zhì)干細(xì)胞采用噴墨打印的方法制備了三維支架，細(xì)胞培養(yǎng)后 21 天檢測(cè)發(fā)現(xiàn)膠原及堿性磷酸酶的表達(dá)均增高，說(shuō)明具有較好的成骨能力。

細(xì)胞活性因子是骨組織工程的三大要素之一，能影響細(xì)胞的生物學(xué)行為如細(xì)胞募集、增殖和分化等。當(dāng)前骨組織工程的研究重點(diǎn)之一是構(gòu)建模擬人體微環(huán)境的支架材料，作為細(xì)胞外基質(zhì)為種子細(xì)胞提供良好的環(huán)境，并促進(jìn)骨組織的再生，在支架材料上修飾細(xì)胞活性因子就是方法之一［32］。有研究將生物活性因子復(fù)合到打印完成的骨組織支架上構(gòu)成活性人工骨，植入動(dòng)物體內(nèi)修復(fù)骨缺損［33］。但是采用三維打印同步裝配細(xì)胞因子更具優(yōu)勢(shì)，它可以同時(shí)打印不同組分，并且配比精確，有利于構(gòu)建更接近人體微環(huán)境的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。目前常用于骨組織工程的細(xì)胞因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （bone morphogenetic protein，BMP）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源生長(zhǎng)因子 （platelet-derived growth factor，PDGF）、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、胰島素生長(zhǎng)因子 （insulin-like growth factor，IGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 （transforming growth factor beta，TGF-β）等［34］，其中常用于三維生物打印的有 BMP、FGF、IGF 等［35-39］。近年來(lái)有研究將細(xì)胞活性因子負(fù)載于生物材料上共同打印出骨組織支架，并進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，取得了初步成果。Poldervaart 等［36］將 BMP-2 負(fù)載于明膠微粒上，采用三維打印技術(shù)打印出水凝膠支架，發(fā)現(xiàn) BMP-2 能夠在 3 周內(nèi)持續(xù)釋放，并促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與骨向分化，將該支架植入小鼠或大鼠皮下可見顯著的成骨表現(xiàn)。

由于生物大分子容易受到酸、堿、熱等理化因素的影響而發(fā)生變性，所以要實(shí)現(xiàn)共同打印細(xì)胞、細(xì)胞因子及生物材料的目標(biāo)，就要求打印過(guò)程中的溫度、環(huán)境及所使用的交聯(lián)劑等對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞因子的活性沒(méi)有影響，所以打印條件相對(duì)溫和的噴墨打印技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越多。在打印機(jī)的墨水盒內(nèi)按需裝入配比好的混合材料，選擇不同的細(xì)胞、細(xì)胞因子和支架材料等組成“生物墨水”［14］。在打印過(guò)程中，細(xì)胞僅有 4 ℃～10 ℃ 的升溫，存活率至少達(dá)90%，具有較好的細(xì)胞相容性，能在不損害細(xì)胞活性、不改變細(xì)胞基因型的同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的微觀分布［27，40］。Xu 等［41］成功地利用熱發(fā)泡式噴墨打印機(jī)打印中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞和胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞，并保持其生物活性。Campbell 等［37］利用噴墨打印技術(shù)成功將活性 FGF-2 打印到纖維蛋白膜上。Cooper 等［35］采用噴墨打印技術(shù)將 BMP-2 混入三維多孔骨支架中，并證實(shí) BMP-2 的存在有效地促進(jìn)細(xì)胞分化和骨組織生成。這些都證明了利用三維打印技術(shù)在體外構(gòu)建器官替代物甚至打印活器官的可行性。

三維生物打印技術(shù)尚處于起步階段，還有許多問(wèn)題需要解決，其中最主要的就是探索更好地保持細(xì)胞和細(xì)胞因子生物活性的方法。隨著三維生物打印技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞因子與生物材料共同打印技術(shù)的研究將不斷深入，直接打印與正常骨組織結(jié)構(gòu)、功能相仿的人工骨將成為可能，有望解決大段骨缺損治療的難題。

四、總結(jié)與展望

三維打印技術(shù)在打印材料、細(xì)胞和細(xì)胞活性因子等方面已經(jīng)取得了一定成果，三維打印支架也開始應(yīng)用于骨組織工程，但大多處于體外試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。目前尚無(wú)產(chǎn)品化的打印支架用于骨組織工程，還有許多亟待解決的問(wèn)題，如：如何獲得生物學(xué)性能和機(jī)械學(xué)性能更佳的材料？如何調(diào)控材料的降解速度？如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在支架內(nèi)按照預(yù)制組織結(jié)構(gòu)分布？如何構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)通道等？這些都是未來(lái)研究的方向。三維打印的醫(yī)療器械需要制定相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制，以確保其使用的安全性。

總之，三維打印技術(shù)在骨組織工程中具有廣泛地應(yīng)用前景，但其未來(lái)發(fā)展的道路漫長(zhǎng)而曲折，需要生命科學(xué)、材料學(xué)和工程學(xué)等多學(xué)科的整合和突破。

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（本文編輯：李貴存）

Applications and progress of three-dimensional printing technique in bone tissue engineering

ZHOU Yi， XIA Yang，ZHANG Fei-min. Jiangsu Key Laboratory of Oral Diseases， Nanjing Medical University， Nanjing， Jiangsu， 210029， PRC Corresponding author： XIA Yang， Email： xiayangxy@sina.com

Bone tissue engineering includes 3 basic factors： cells， scaffolds and cytokines. The fast developments of bone tissue engineering provide new approaches for better restoration and reconstuction. Among them， new methods to fabricate optimal personalized scaffolds by three-dimensional （3 D）bioprinting technique draw much attention. 3 D bioprinting is a branch of 3 D printing in biomedicine. It builds up a 3 D structure by printing with biomaterials and / or cells （cytokines）. As a novel technique in tissue engineering， 3 D bioprinting performs better than traditional techniques. It can fabricate personalized scaffolds with high porosity and proper pore size easily and rapidly， and the scaffolds can meet the requirement of biocompatibility and mechanical strength in tissue engineering. Moreover， cells or cytokines can be deposited into biomaterials during printing， which can make the scaffolds both osteoinductive and osteoconductive. Although 3 D bioprinting has already been applied， it is still at a preliminary stage and improvement is still in need. It is important to search for the suitable approach for the deposition of cells and cytokines， to explore the way to maintain the bioactivity， and to develop new biomaterials for 3 D biopringting. With the development of medical imaging， digital medicine and new biomaterials， 3 D bioprinting will be used more and more in bone tissue engineering.

Tissue engineering；Biocompatible materials；Cytokines；Computer-aided design；Bioprinting，three-dimensional

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.010

R318

國(guó)家自然科學(xué)基金 （81400486）；江蘇省自然科學(xué)基金 （BK20140911）；江蘇省博士后基金 （1402044B）；中國(guó)博士后基金 （2015M571647）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目 （2014-37）

210029江蘇，南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

夏陽(yáng)，Email： xiayangxy@sina.com；

2015-06-19）